脂肪酶的制備方法有提取法、化學合成法和微生物發酵法。
提取法資源有限、工藝復雜、產量低；
化學合成法成本太高；微生物發酵法的應用前景要遠遠大于提取法和化學合成法，它不受環境影響，資源豐富，產酶周期短，產物較單純且成本低，生產上易于管理。商品化脂肪酶主要來源于各種細菌、酵母和真菌等微生物的發酵，有些霉菌可通過固態發酵及液體深層發酵兩種方法進行發酵。
通過傳統誘變育種以及優化發酵條件提高了脂肪酶的產量，使得許多脂肪酶實現了產業化生產，尤其是基因工程的引入，大大提高了脂肪酶的產量。由于提取材料來源和酶含量的因素，動植物脂肪酶主要應用于科學研究。