脂酰CoA在線粒體基質中進入β氧化要經過四步反應，即脫氫、加水、再脫氫和硫解，生成一分子乙酰CoA和一個少兩個碳的新的脂酰CoA。
第一步脫氫(dehydrogenation)反應由脂酰CoA脫氫酶活化，輔基為FAD，脂酰CoA在α和β碳原子上各脫去一個氫原子生成具有反式雙鍵的α,β-烯脂肪酰輔酶A。
第二步加水（hydration）反應由烯酰CoA水合酶催化，生成具有L-構型的β-羥脂酰CoA。
第三步脫氫反應是在β－羥脂肪酰CoA脫飴酶（輔酶為NAD+）催化下，β-羥脂肪酰CoA脫氫生成β酮脂酰CoA。
第四步硫解（thiolysis）反應由β－酮硫解酶催化，β-酮酯酰CoA在α和β碳原子之間斷鏈，加上一分子輔酶A生成乙酰CoA和一個少兩個碳原子的脂酰CoA。
上述四步反應與TCA循環中由琥珀酸經延胡索酸、蘋果酸生成草酰乙酸的過程相似，只是β-氧化的第四步反應是硫解，而草酰乙酸的下一步反應是與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。
長鏈脂酰CoA經上面一次循環，碳鏈減少兩個碳原子，生成一分子乙酰CoA，多次重復上面的循環，就會逐步生成乙酰CoA。