臍帶和臍血來源干細胞的培養實驗_臍帶和臍血的準備

臍帶

培養基：臍帶運輸培養基：Eagle基礎培養基（EBM)添加300 U mL青霉素300 μg mL鏈霉素150μg mL慶大霉素和lμg mL兩性霉素B。 MSCs培養基：含2 mmol L的左旋谷氨酰胺的低糖DMEM(LG-DMEM)添加10% 熱滅活胎牛血清（FBS)100 U mL青霉素和l00μg mL鏈霉素。

夾子針頭注射器

(a)出生后，用兩個夾子在近新生兒的末端和近胎盤的末端夾住臍帶以封閉臍帶;

(b)剪下兩個夾子間的臍帶，一端在接近新生兒處，另一端剪去胎盤；

(c)剪下臍帶后放入運輸培養基中送去實驗室，整個處理過程在6?12 h內。

(a)夾住臍帶，盡可能靠近新生兒處剪斷臍帶。

(b)用Betadine或70%酒精的棉花擦拭針頭插入位點，位點在臍帶近胎兒末端。

(c)為了收集到最大量的臍血，臍帶的處理動作要盡可能小。

(d)接著用收集袋或50mL注射器的針頭插人步驟b中處理好的臍靜脈插人位點。

(e)將收集袋保持在低于插人位點水平，以利于臍血在重力作用下流人容器中，或者用50mL注射器緩慢地將臍血從躋靜脈內抽出。盡量多地收集臍血，一般能收集到60?150mL。

(f)如果出現靜脈滑脫，可沿臍帶稍向上處用Betadine或70%乙醇消毒后重新插入針頭。

(g)血流停止后，打開針頭安全帽，將它推入鎖定位置。注意：臍血應該保存于室溫，不要冷藏。

(h)如果使用袋裝，用附帶的卡環夾住管子，盡可能接近血袋處打兩個安全結以防止泄露，然后剪去針頭，將針頭放人尖頭容器中丟棄。

(i)輕輕轉動血袋或注射器幾次，使臍血與抗凝劑充分混合

其他試劑：

滅活胎牛血清（FBS)，100 U/mL青霉素和l00μg/mL鏈霉素。

用于造血干細胞的IMDM：含2 mmol/L的左旋谷氨酰胺的IMDM，添加1% 牛血清白蛋白，10μg/mL胰島素，0.l mmol/L 2-巰基乙醇，50 U/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素。

用于造血干細胞和MSCs共培養的IMDM:IMDM添加10% 熱滅活FBS,100 U/mL青霉素和 100μg/mL鏈霉素。

用于臍帶血來源多能祖細胞的DMEM：含2 mmol/L的左旋谷氨酰胺的高糖DMEM (HG-DMEM), 添加10% 熱滅活胎牛血清（FBS)，l00 U/mL青霉素，l00μg/mL鏈霉素和100 ng/mL粒細胞巨膝細胞-集落刺激因子（GM-CSF)。

PBSA:Dulbecco’sPBS溶液A(無鈣鎂離子)、過柱緩沖液：pH7.2的PBSA，添加0.5% 牛血清白蛋白和2 mmol/L EDTA或0.6%枸櫞酸葡萄糖 A方（ACD-A）。用真空裝置除去緩沖液中的氣體。ACD-A: 枸櫞酸葡萄糖A方（0.6%ACD-A)和0.5% 的牛血清白蛋白（第 V 組分）。膠原酶 A，0.1% 用 PBSA 配制胰蛋白酶，0.05% 胰蛋甶酶用 PBSA 配制，含 0.53 mmol/LEDTA;2.5% 胰蛋白酶用 PBSA 配制。抗凝血劑：枸櫞酸葡萄糖腺苷（CPDA-1):122 mmol/L(26 g/L) 枸櫞酸鈉，0.142mol/L (25.5 g/L) 葡萄糖，15.6 mmol/L(3.0 g/L)枸櫞酸和18.3 mmol/L(2.2 g/L)磷酸二氫鈉。