1966年,Yamamoto和McIlwain首次在腦片上記錄了電生理活動(1966a,
b),證實了腦組織在體外也能存活,并保持很好的活性狀態。此后,該方法在生理學研究中的應用越來越廣泛,并為中樞神經系統生理和藥理學領域突飛猛進的發展奠定了基礎。1989年,Blanton將腦片電生理記錄與細胞的膜片鉗記錄結合起來,建立了腦片膜片鉗記錄技術,這為在細胞水平研究中樞神經系統離子通道或受體在神經環路中的生理和藥理學作用及其機制提供了可能性。
在腦片電生理記錄中,實驗者可以按不同的實驗目的直接準確地改變腦片灌流液的成份和條件,如溫度、酸度和滲透壓、通氧狀態、以及離子通道或細胞信號轉導通路的阻斷劑等;另外,實驗者還能借助顯微鏡準確地放置記錄電極和刺激電極,同時,可借助一些特殊的加藥裝置,將一定濃度的藥物加到整個腦片或是腦片上的特定區域上,研究電信號沿神經環路的傳遞規律。在電生理學實驗結束后,活性較好的腦片還可用于生物化學或解剖學的分析。這些優點使實驗者能獲得準確的神經生理學的研究結果,也是其應用較在位大腦廣泛的原因所在。
海馬腦片是中樞神經系統研究中應用最為廣泛標本之一。其原因有以下幾點:1、海馬與腦的其它部位相對隔離,較易剝離,且剝離后受到的損傷較小;2、海馬具有高度分化的片層結構,一方面,海馬神經環路在片層中的分布有一定的空間規律,如錐體細胞胞體分布在錐體細胞層,而雪氏側支突觸分布于輻射層,且海馬中存在一個三突觸聯系的回路,即穿通纖維-齒狀回顆粒細胞層、苔狀纖維-CA3區錐體細胞層、雪氏側支-CA1區錐體細胞層等,因此,在海馬中可以較準確地記錄到特定神經元或突觸的反應;另一方面,這種板層結構有利于解釋在某一部位記錄到的細胞外場電位的意義。這些都使海馬成為電生理學研究的理想標本。本文對海馬腦片膜片鉗的操作規程及注意事項總結如下。
一、海馬腦片的制備
腦片制備中,海馬分離應在斷頭后10分鐘內完成,5~6分鐘為宜。在分離海馬時,還應注意不要扭轉或撕扯海馬,更不要損傷海馬。分離海馬的速度和質量是保證海馬腦片制備成功的關鍵所在。
評價腦片活性最簡單的方法是記錄腦片上的群峰。在一個狀態良好的腦片上記錄到的群峰在一個很寬的刺激強度范圍內始終是單峰的。出現多個群峰往往提示抑制性突觸功能已受損,這是腦片最早的病理生理學改變。如果僅存在突觸前纖維群峰(Fiber
Volley,
FV),或FV峰大于突觸后反應,這提示腦片活性極差,有活性的突觸已所剩無幾,為激發突觸反應需要更多的突觸前纖維參與,需中止實驗。在活性較好的腦片中,FV峰幾乎探測不到,或遠遠小于突觸后反應。
有時會莫名其妙地出現一些問題,突觸標本中突觸后神經元看上去狀態良好,但做了很多天甚至幾周都沒有得到有用的數據。在這種情況下,須要耐心地思考失敗的原因,并設法解決。首先,應該檢查溶液,用其它實驗室制備的標本或更換實驗動物。對于腦片的制備而言,切片機出現的機械故障會損壞腦片的質量。總之,在實驗的全過程中能盡量注意每一個細節問題,出現問題后反復嘗試,實驗就會容易起來。