脫水蔬菜中沙門氏菌不同檢測方法的對比研究

脫水蔬菜是我區重要的出口產品之一 ,其質量直接影響創匯。近幾年來無論是消費者還是檢驗機構對食品的安全衛生問題日趨重視 ,在我國加入ＷＴＯ后 ,越來越多的外商在外貿合同中嚴格規定了對脫水蔬菜中沙門氏菌進行檢測的條款 ,而現在常用的檢測沙門氏菌的方法是按國家標準ＧＢ4 789.4 - 94 (1) 進行的 ,該方法繁瑣復雜 ,檢測時間太長 ,已遠遠不能滿足對外貿易的需要。近些年來 ,隨著科學技術的飛速發展 ,出現了一種新型的微生物檢測儀器———自動熒光酶標分析儀 (ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ) ,并已在禽肉制品、乳制品沙門氏菌檢測中得到了初步試驗(2 ) ,但在脫水蔬菜的沙門氏菌檢測中 ,報道較少。本課題的研究 ,主要應用“自動熒光酶標分析儀”檢測沙門氏菌并與國家標準ＧＢ4 789.4 -94檢測方法進行比較 ,以加快脫水蔬菜檢驗微生物指標的檢測速度 ,從而進一步把好出口脫水蔬菜的質量關。1　方法和器材1.1　儀器及試劑儀器 :自動熒光酶標分析儀 (ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ)培養基 :按國家標準和自動熒光酶標分析儀操作手冊分別制備相應的培養基。標準菌株 :傷寒沙門氏桿菌 ,菌株編號 5 0 0 86 - 4 ,來自于國家質檢總局商檢研究所。1.2　樣品制備兩種檢測方法的采樣制樣方式基本相同 ,均按國家標準ＧＢ4 789.1- 94 (3 ) 和ＧＢ4 789.4 - 94中的要求進行。1.3　實驗方法1.3.1　ＧＢ4 789.4 - 94方法稱取 2 5ｇ脫水蔬菜樣品加入裝有 2 2 5ｍｌ緩沖蛋白胨水的瓶中 ,于 36± 1℃培養 4ｈ ,然后各吸取 10ｍｌ分別轉種于10 0ｍｌ氯化鎂孔雀綠增菌液和 10 0ｍｌ亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中 ,于 36± 1℃培養 18～ 2 4ｈ。取上述增菌液 1環劃線接種于 1個亞硫酸鉍瓊脂平板 (ＢＳ)和 1個ＤＨＬ瓊脂平板上 ,于 36± 1℃培養 18～ 2 4ｈ(ＤＨＬ)或 4 0～ 4 8ｈ(ＢＳ) ,觀察菌落。挑取可疑菌落分別接種于三糖鐵瓊脂、蛋白胨水 (靛基質 )、尿素瓊脂、氰化鉀培養基和賴氨酸脫羧酶培養基 ,于 36±1℃培養 18～ 2 4ｈ ,對以上生化反應進行結果判斷 ,必要時補做ＯＮＰＧ、甘露醇和山梨醇試驗。報告結果。1.3.2　自動熒光酶標分析儀 (ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ)方法原理 :以酶聯熒光免疫 (ＥＬＦＡ)為基礎檢測沙門氏菌抗原 ,所有試驗步驟均由ＶＩＤＡＳ系統自動完成。固相容器(ＳＰＲ)起固相和加樣器作用 ,ＳＰＲ用高度特異的單克隆抗體包被。待測樣本經過前增菌、選擇性增菌和后增菌后 ,再將煮沸過的增菌肉湯加于試劑條上 ,樣本將在ＳＰＲ內自動定時循環 ,如果樣本中有沙門氏菌抗原則與ＳＰＲ內側包被的單克隆抗體結合 ,所有未結合的樣本則被洗去。標記有堿性磷酸酶的抗體在ＳＰＲ內、外循環并與ＳＰＲ壁上的任何沙門氏菌抗原結合 ,最后洗去未結合的復合物。底物磷酸 4 -甲基傘形酮則被ＳＰＲ壁上的酶分解成有熒光的產物 4 -甲基傘形酮 ,ＶＩＤＡＳ的光掃描儀自動測定其熒光強度 ,根據所測熒光強度得出試驗值 (ＲＦＶ)并和標準比較 ,然后判斷出樣本陽性或陰性結果。方法 :將脫水蔬菜樣品按 1∶10比例稀釋于緩沖蛋白胨水中 ,在 36± 1℃培養 18～ 2 4ｈ。以下操作分兩步進行 :(1)吸取 0 .1ｍｌ緩沖蛋白胨水加于 10ｍｌＲＶ肉湯中 ,在 4 1～ 4 2℃培養 6～ 8ｈ ,然后吸取 1ｍｌＲＶ肉湯加到 10ｍｌＭ肉湯中于 4 1～ 4 2℃培養 18ｈ ;(2 )吸取 1ｍｌ緩沖蛋白胨水加于 10ｍｌ亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中在 35～ 37℃培養 6～ 8ｈ ,然后吸取 1ｍｌ亞硒酸鹽胱氨酸增菌液加到 10ｍｌＭ肉湯中于 4 1～ 4 2℃培養 18ｈ。最后再從 (1) (2 )兩步中的Ｍ肉湯里各吸取 1ｍｌ放入同一試管中于 10 0℃水浴中煮沸 15ｍｉｎ ,然后吸取 5 0 0 μｌ按儀器使用說明注入試劑條中 ,上機操作。儀器運行 4 5ｍｉｎ后自動分析結果并打印出報告。1.3.3　用沙門氏菌標準菌株按以上兩種方法增菌培養并和脫水蔬菜樣品同步進行測試。2　結果 (附表 )3　討論3.1　運用以上兩種方法對同一種脫水蔬菜樣品和沙門氏菌標準菌株進行對比試驗 ,其結果完全一致 (見附表 )。3.2　國家標準ＧＢ4 789.4 - 94作為檢驗沙門氏菌的常規經典培養方法 ,其檢驗結果是準確可靠的 ,但是檢驗時間太長(一般需要 5～ 7天 ) ,過程復雜 ,已經不太適應進出境食品快速檢驗的要求 ,而且沙門氏菌作為一種食源性的致病菌是食品安全衛生檢驗中的必檢項目 ,其危害性也要求醫療機構和檢驗機構能夠快速鑒別。3.3　本次實驗初步驗證了自動熒光酶標分析儀 (ＭＩＮＩＶＩ ＤＡＳ)檢測脫水蔬菜中的沙門氏菌具有自動化程度高、時間短 (4 8小時即可出結果 )、操作簡便、靈敏度強等優點 ,但是該儀器所配備的試劑價格較貴 ,導致其檢測費用比常規培養方法略高 ,因此較為適合樣品檢測量多的檢驗機構、食品企業以及醫療衛生機構。3.4　常規培養方法是通過增菌、分離、生化試驗、血清學分型鑒定等過程來檢測沙門氏菌 ,而自動熒光酶標分析儀(ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ)只需要對增菌液進行檢驗 ,就能用已知的抗體來檢測相對應的抗原 ,從而判定樣品中是否含有沙門氏菌。3.5　本次實驗僅限于脫水蔬菜樣品的檢驗 ,對于其它種類的食品有待于作進一步更深入的試驗研究。4　結論通過本次對比實驗我們初步認為 ,自動熒光酶標分析儀 (ＭＩＮＩＶＩＤＡＳ)檢測脫水蔬菜中的沙門氏菌 ,其結果是較為可靠的 ,檢測時間也比常規培養方法大為縮短。因此作為一種快速初篩方法用來檢測沙門氏菌是完全可行的 ,符合快速檢測的要求。