膜蛋白提取方法

膜蛋白具有許多重要的細胞功能，對生物體存在至關重要。他們具有超過 60% 的藥物靶點，占細胞總蛋白的 20%-30%。膜蛋白包括完整的膜蛋白，跨膜蛋白和外周膜蛋白。

膜蛋白或者附著在脂質雙分子層上或者通過疏水，離子或其他非共價與膜周邊的完整蛋白結合。

使用表面活性劑進行質膜蛋白分離提取效率不高，還有可能破壞蛋白質 - 蛋白質相互作用，改變膜蛋白的拓撲結構。

在一些下游應用中，例如膜蛋白 IP，Co-IP，酶檢測，質譜分析實驗，使用無表面活性劑的方法分離質膜蛋白遠遠好過使用表面活性劑的方法。多年來，使用無表面活性劑方法提取質膜蛋白大致可以分為以下三類方法：

A． 傳統的蔗糖梯度離心（SGU）：傳統的蔗糖梯度離心法自上世紀 60-70 年代開發，至今仍被許多實驗室用于質膜蛋白提取，蔗糖梯度離心可以將細胞蛋白分離成不同的組分和高度濃縮的膜蛋白。這種傳統的方法需要大量的起始材料，操作過程復雜耗時。

B． 雙水相親和性分離：此方法的特點是大多數的親水性聚合物對在水溶液中是不相容的，產生兩個共存相，相互平衡。利用這個性質可以分離許多生物分子包括膜蛋白。該方法相對簡單，快速，但是所需的起始細胞數相對較高，且產量相對較低。

C． 離心管柱法：使用離心管柱分離技術起始材料僅需 2*107 個細胞，即可將細胞 / 組織分離為細胞漿，細胞核，細胞器和質膜組分。

離心管柱帶有特定孔徑和表面性質，當細胞通過離心管柱，細胞膜被破裂分離出完整的細胞核，隨后通過差速離心和密度離心分離出質膜蛋白，無需使用超高速離心。可以應用于 SDS-PAGE、immunoblottings、ELISA、IP、Co-IP、MS、2-D、酶活性檢測等其他應用。

離心管柱法膜蛋白提取操作方法：

1. 將離心管柱及接收管套管放置冰上預冷。

2. 細胞樣品，低速離心（500-600Xg，5 分鐘）收集 1-50 X 106 個細胞。接轉 3a 步驟。組織樣品，接轉 3b 步驟。（貼壁細胞樣品建議使用細胞刮刀收集，盡量不使用胰酶消化） 注意：從細胞樣品中分離質膜蛋白，建議細胞量為 20-50 X 106 個細胞。

3a. 用預冷的 PBS 清洗一次細胞。去除上清，在 Buffer A 中重懸細胞（起始細胞數小于 5X 106 加入 200ul Buffer A，起始細胞數大于 5X 106 加入 500ul Buffer A）。冰上孵育 5-10 分鐘。渦旋大力震蕩 10-30 秒。迅速將細胞懸液轉入離心管柱中。接轉步驟 4.

3b. 組織樣品，將新鮮組織（10-30mg）或冷凍組織（20-30mg）放置于離心管柱上。加入 200ul Buffer A，用塑料棒反復扭轉研磨組織 1 分鐘（注意：如果你的樣品是骨骼或是心肌，建議在研磨前加入 100-200mg 組織分離粉）。再加入 300ul Buffer A，用吸頭吹打幾次后，開蓋冰上孵育 5 分鐘。接轉步驟 4.

注意：存在少量的非均質組織不會影響樣品的質量。塑料棒可重復使用。用 75% 酒精擦拭或用蒸餾水沖洗干凈。

4. 蓋上蓋子，16,000Xg，離心 30 秒。（此步驟推薦使用可在 10S 內達到離心力的臺式離心機，離心機的離心力和升速時間會影響膜蛋白得率）優化：細胞樣品建議第 4 步完成后再次重懸細胞，轉移回離心管柱中，16,000Xg 再次離心 30 秒，重復此步驟可以增加 20-30% 產量。

5. 棄去離心管柱，渦旋大力震蕩 10 秒重懸細胞。

6.700Xg，離心 1 分鐘（沉淀是完整的細胞核）。將上清轉移到新的 1.5ml 離心管中，4℃，16000Xg 離心 10-30 分鐘（延長離心時間可以增加產量），棄去上清（上清為胞漿組份），保存沉淀（沉淀為總膜蛋白組份包括細胞器和質膜）。

如果不需要分離質膜做到此步驟即可，產量一般為 10-500ug / 樣品。可將總膜組份存儲于 - 70℃或者根據下游實驗選擇溶解液溶解。如果需要提取質膜，請不要冷凍總膜組份。分離質膜繼續第 7 步驟。

7. 加入 200ul Buffer B 用吸頭反復吹打或渦旋震蕩重懸總膜蛋白組份。4℃，7800Xg，離心 5 分鐘（注意：如果最終質膜組份中含有細胞器膜污染，此步驟離心時間可增加到 20 分鐘提高純度，第一次使用建議按照說明書操作，無需調整離心時間）。沉淀部分為細胞器。

8. 小心的將上清液轉移到新的 2.0ml 離心管中，加入 1.6ml 預冷的 PBS 混勻幾次。16000Xg，離心 15-30 分鐘（延長離心時間可以增加產量）。棄去上清液，保存沉淀（沉淀為質膜蛋白）。產量一般為 10-300ug / 樣品。質膜蛋白可以根據下游實驗需求用 20-200ul 含表面活劑的緩沖液溶解。

推薦使用下表中 MinuteTM 系列溶解液溶解膜蛋白。做等電聚焦（2D 凝膠第一維）我們建議使用：7M 尿素 / 2M 硫脲 / 2%Chaps 和 20mM DTT (使用前將 DTT 加入以上混合液中)。

傳統的蔗糖梯度離心和雙水相親和性分離方法都需要通過特殊設備（勻漿機，攪拌機或超聲波）勻漿來打破細胞膜，使用勻漿設備無法避免由于力度和時間不同造成的人為誤差，是實驗間差異的主要來源。

相比之下，使用離心管柱法提取膜蛋白，不需要使用任何勻漿設備，并且試劑盒不使用表面活性劑，操作簡便，速度快，性能好，離心管柱法提取膜蛋白將成為越來越多研究人員的正確選擇！