膜蛋白的純化實驗（二）

三、膜蛋白的純化

一 旦 使 用 了 合 適 的 去 污 劑 將 膜 蛋 白 從 細 胞 膜 中 増 溶 出 來 ，就 可 以 分 離 目 標 蛋 白 質 了 。傳 統 色 譜 層 析 技 術 ，如 凝 膠 過 濾 、親 和 、離 子 交 換 和 層 析 聚 焦 （chromatofocusing)等 都 可以 用 于 膜 蛋 白 純 化 。然 而 ，在 去 污 劑 存 在 條 件 下 使 用 色 譜 層 析 需 要 注 意 以 下 幾 點 。

(1) 使用足量的去污劑，以維持整合膜蛋白在緩沖液中處于可溶形式并防止蛋白質聚集。

(2) 由于大多數去污劑具有疏水性，基于蛋白質疏水性的蛋白質分離方法，如苯基-瓊脂糖凝膠和反相層析也許不適于膜蛋白的純化。

(3) 增溶膜蛋白的離子型去污劑，如膽酸鹽或脫氧膽酸鹽，不適用于離子交換層析。非離子型或兼性去污劑則可用于基于電荷的制備技術, 包括離子交換層析和制備電泳。

(4) 含糖基的去污劑也許會干擾特定的凝集素層析，如 辛 基 葡 糖 苷 會 干 擾 ConA層 析 。

(5) 由于溶解的膜蛋白處于去污劑膠束中，在凝膠過濾中膜蛋白具有更大的表觀分子質量。能形成大分子質量膠束的去污劑，如 Trtion X-100, 會使溶解的膜蛋白的分子質量 增 加 60?100 kDa。因此, 大多數蛋白質會出現在高分子質量部分，從而使基于分子大小的蛋白質分離變得困難。

(6) 膜蛋白與去污劑膠束的結合，特別是具有大膠束尺寸或本身為離子型的去污劑，會遮蔽膜蛋白的電荷。因此，離子交換層析分離膜蛋白的能力也許不如非膜蛋白。

(7) 整體而言，親和層析是目前純化整合膜蛋白最有用和最成功的方法, 并且在各個純化階段都能使用。由于離子交換層析對緩沖液的離子強度敏感，而凝膠過濾要求相對小體積的濃縮樣本, 因此親和層析可以用于純化、濃縮以及在不同層析步驟中進行鹽置換 。幾種常用的膜蛋白純化的親和層析方法將在下面的部分中闡述。

4.1 凝集素親和層析

有 3 種類型的親和層析分別使用一般配體(如凝集素）、特異性配體(如酶抑制劑、激素)和抗體。固定的凝集素是親和層析的常見形式。凝集素是糖結合蛋白，可用于快速并溫和地純化質膜糖蛋白。凝集素-糖的相互作用可逆并且可以被單糖抑制。由于膜蛋白常常是糖基化的，因此凝集素層析對于純化膜蛋白非常有用。 目前已經鑒定了大量的凝集素 ，其中使用最廣泛的是ConA[結合右旋甘露糖ct(crI> mannose)]和麥胚凝集素[germ
agglutinin, 結合唾液酸和乙酰氨基葡萄糖(3(sialic acid and ^ I> GIcNAc)]。這里需要提及使用凝集素親和層析的幾個方面。首先 ，目標蛋白質是否能夠與特異的凝集素結合需要實驗驗證。由于不同的組織具有不同的糖基化酶，有時在相同動物的不同組織表達的同一糖蛋白也許會具有不同的凝集素結合特異性。其 次 ，特定的凝集素的親和層析純化的是一組具有特定糖基化類型的糖蛋白，因此并不能達到配體或抗體親和層析方法達到
的純化程度。最 后 ，凝集素對特定類型的去污劑敏感。雖然非離子型去污劑，如 Tritonx -100(可 至 2. 5 % ，m /V )對 C o n A 或麥胚凝集素配體結合活性的影響可以忽略，但一些離子型去污劑，如 S D S 也許會失活凝集素。

下面是一個使用凝集素柱純化膜蛋白的實驗方案范例。

(1) 轉 移 2 mL麥胚凝集素(WGA)-瓊脂糖到一 次性的塑料柱子(PolyPrep，Bio-RadLaboratories) 中 ，清 洗 WGA-瓊 脂 糖 親 和 基 質 。用1〇 mL 清 洗 緩 沖 液 [50 mmol/LH E P E S ( p H 7. 〇 、0.1 % 去污劑]充滿柱子，讓洗液流過柱子以除去未結合的W G A 和保存緩沖液。

(2) 在溶解的細胞膜提取物中加入清洗過的WGA-瓊脂糖。在室溫轉動或振蕩器上振 蕩 3〇 min, 使 WGA-瓊脂糖和可溶細胞膜提取物混合。

(3) 600 r/m in 離 心 I m in 以沉淀 WGA-瓊脂糖。用移液管吸出上清液。加 入 1〇倍體積(基于WGA-瓊脂糖的體積)的洗液，顛倒數次。

(4) 重復步驟(3)兩次。

(5) 加 人 2 m L 洗液到W G A -瓊脂糖，再 將 W G A -瓊脂糖移回柱子。用 5?10倍柱體積的洗液清洗。定時進行蛋白質檢測，如用考馬斯亮藍蛋白質檢測方法直到蛋白質水平降至背景值，即與洗液中蛋白質水平相似。

(6) 加人一半柱體積的洗脫緩沖液, 如5〇 mmol/L H E PE S(PH 7. 4)、0. 1 % 去污劑、0?25m 〇I/L N -乙酰氨基葡糖, 從W G A -瓊脂糖上洗脫糖蛋白。收集洗脫部分。

(7) 加人一半柱體積的洗脫緩沖液, 收集洗脫部分。

(8) 重復步驟(7)4次。

(9) 檢測洗脫液中的蛋白質濃度。例如, 從每份洗脫液中吸出5 pL 并用考馬斯亮藍方法檢測蛋白質濃度。將適當的部分匯集在一起。

4.2 配 體 親 和 層 析

配體親和層析成功的關鍵是配體和受體的親和要足夠強，能夠允許純化步驟中的結合和清洗。配體通常通過偶聯固定到親和基質（affinity support)上 。由于去污劑的存在 ，配體(或抑制劑）和受體的親和性也許會被改變。因此, 如果使用配體親和柱純化, 關鍵在于選擇不會顯著降低受體和配體親和活性的去污劑。

4.3 抗 體 親 和 層 析

如果有可用的抗體，則使用特定膜蛋白的固定化抗體是純化膜蛋白最有力的方法。抗體在非離子型去污劑中相對比較穩定，因此能夠與溶解的細胞膜制備物中的去污劑兼容 。困難在于從免疫親和柱上洗脫膜蛋白（ 詳 見 第 2 8 章）。

四、去污劑的去除和置換

如果將去污劑完全去除，大多數膜蛋白會聚集并沉淀。因此，為了保持膜蛋白的功能 ，在去除一種去污劑的同時通常會引入另一種去污劑。在一些情況下, 如在起始增溶階段 ，樣品中過量的去污劑會干擾蛋白質的活性和濃度測量，這時需要去除過量的去污劑。在 另 一 些 情 況 下 ，用 于 增 溶 的 起 始 去 污 劑 也 許 不 適 于 后 續 的 層 析 或 分 析 步 驟 ，有 必 要 置 換為 另 一 種 去 污 劑 。例 如 ，離 子 型 去 污 劑 與 離 子 交 換 層 析 和 等 電 聚 焦 不 兼 容 ，需 要 將 其 置 換為 非 離 子 或 兼 性 去 污 劑 。如 果 膜 蛋 白 需 要 重 組 合 到 磷 脂 囊 泡 中 ，需 要 改 為 具 有 高 臨 界 膠束 濃 度 的 去 污 劑 , 從 而 可 以 通 過 透 析 方 法 除 去 去 污 劑 而 使 膜 蛋 白 重 組 合 到 磷 脂 囊 泡 中 。去 污 劑 是 否 容 易 去 除 與 其 性 質 具 有 很 大 關 系 。高 臨 界 膠 束 濃 度 (>1 mmol/L) 的 去 污 劑 ，如 膽 酸 鹽 和 辛 基 葡 糖 苷 ，透 析 或 超 濾 就 能 輕 易 去 除 。低 臨 界 膠 束 濃 度 (<1 mmol/L) 的去污 劑 ，如 非 離 子 型 去 污 劑 Triton X-100、C12E9 、Brij、Tween，很 難 通 過 透 析 去 除 ，可 以 使用 層 析 基 質 吸 附 、凝 膠 過 濾 、平 衡 的 方 法 。去 污 劑 的 去 除 和 置 換 方 法 見 第 4 1 章 。

五、重組整合膜蛋白的表達和純化

蛋 白 質 結 構 研 究 或 為 了 生 產 針 對 膜 蛋 白 的 抗 體 ，通 常 需 要 表 達 和 純 化 重 組 的 整 合 膜蛋 白 以 獲 得 足 量 蛋 白 質 。膜 蛋 白 通 常 采 用 哺 乳 動 物 細 胞 或 昆 蟲 細 胞 表 達 。信 號 序 列 對 于將 蛋 白 質 靶 定 到 內 質 網 非 常 重 要 ，它 會 影 響 蛋 白 質 的 合 成 和 翻 譯 后 的 修 飾 。 因 此 ，標 簽 通常 加 在 序 列 末 端 以 避 免 影 響 蛋 白 質 的 膜 靶 向 過 程 。有 時 ，來 自 其 他 蛋 白 質 的 信 號 序 列 被
用 于 提 高 膜 靶 向 的 效 率 。小 的 標 簽 ，如 His6 標 簽 或 短 肽 標 簽 ，不 會 給 蛋 白 質 帶 來 很 大 的改 變 ，還 能 提 高 異 源 細 胞 表 達 膜 蛋 白 的 概 率 。金 屬 親 和 層 析 具 有 高 親 和 能 力 且 不 受 去 污 劑的 影 響 ,Xt 于 表 達 和 純 化 膜 蛋 白 來 說 是 一 個 好 的 選 擇 。其 他 親 和 表 位 標 簽 ，如 FLAG、 Myc或 H A 也 能 使 用 。然 而 ，用 固 定 抗 體 純 化 蛋 白 質 能 力 有 限 并 且 成 本 比 金 屬 親 和 層 析 高 得 多 。

多 篇 文 獻 中 都 可 找 到 表 達 和 純 化 膜 蛋 白 的 例 子 。一 個 例 子 是 用 昆 蟲 細 胞 表 達 和 純 化細 胞 黏 附 分 子 CEACAMKPhanetaL ,2001)。在 這 個 研 究 中 ，被 表 達 的 整 合 膜 蛋 白 C 端有 一 個 7 個 組 氨 酸 的 標 簽 并 采 用 了 原 始 信 號 序 列 ，結 果 發 現 重 組 的 CEACAM1 蛋 白 定 位于 細 胞 膜 。細 胞 被 裂 解 后 用 Triton X- 1 0 0 溶 解 細 胞 膜 ，并 用 金 屬 親 和 層 析 一 步 純 化 帶His 標 簽 的 CEACM1 。