支持方案1 混合用于基因分型的熒光標記的 PCR 產物
支持方案2 混合好的 PCR 產物電泳
1.打開測序儀和電腦。
2.把6%24 cmweU-to-read丙婦酰胺膠的夾子去掉，將多余的膠用水沖洗干凈，把玻璃板上灰塵彈掉。緩慢地移去梳子，用水沖洗掉多余的丙烯酰胺膠。晾干玻璃板或者在干凈的Kimwipe中烤干玻璃板。 對于一個 96 孔需上樣的板子，下面描述的過程使用的是3個32 孔的肢，2個48孔的膠同樣可以使用。 3.打開自動測序儀前面艙的門，把低的緩沖液槽子裝在艙的下面，將一個干凈的膠放在艙里，使其平面正好對著激光室，膠板的底部放在低的槽子的對面。確保膠的方向是正確的，有耳的一面向里。 4.看一下膠掃描的區域是否有黏著在板子上的膠碎片，如果需要，用一塊潮濕的Kim_wipe將其擦干凈。用黑色的間隔片將膠鎖在正確的位置，關上艙門。 5.調整光電倍增管（PMT) 的電壓，用373A 鍵區，選擇MainMenu, 選Calibration, 然后選Configure核查運行的參數。檢查默認的參數，如果需要可進行修改。 運行時間：5 h30 min1070V 出現數據通信的錯誤時運行不會終止 濾過器輪B 激光功率是40mA/30 mW 6.鼠標和鍵盤在Genescan672收集軟件的菜單窗口中選擇Scan和Map，在 373A主菜單上用主鍵區選擇StartPre-run然后PlateCheck。選擇FullScan 開始掃描膠板。 如果讀般的區域是干凈的，掃描將會看起來像平線，在膠的寬面的圖將會全是灰色。如果掃描有明顯的峰和圖上有有顏色的蜂，那是在玻璃板的激光讀數的區域有碎膠或灰塵。這時必須打開電泳艙，將玻璃板的兩面都擦干凈。用潮濕的Kim一wipe擦時最好從水平方向擦拭。重新按照以上描述檢查膠是否干凈，如果需要重復擦拭直到膠讀數的區域是干凈的。 掃描如顯示一個峰包括4種顏色，這是由于膠的不規則造成的，這是不能夠被擦干凈的。然而，隨著緩沖液在膠里跑這個問題會自動消失^如果遇到這樣奇怪的峰，注意掃描窗口峰的X軸，這個值和信道數是等同的，可以用于決定哪一道人造峰將被顯示二根^信道值決定36孔梳子的道數，如果膠不規則則在上樣時跳過這道。 7.用鼠標指示掃描的最低的顏色行，掃描的左下角是1軸和^軸的坐標。檢查最下面一行3^軸的PMT值。 y值應該在800的2〇個單位內，3；值是根據373A鍵區里設置菜單的PMT的值調f的。設置菜單可通過主菜單里的 Caiibration達到。升高pMT值亦升高^值。 8.重復第2~7步直到每個膠板都在電泳艙上裝置好，都是干凈的掃描區域和正確的PMT值。 9.通過旋轉螺旋夾直到墊圈變平和用手旋緊夾子將上面的緩沖液槽安到安全的玻璃板上。加IXTBE電泳緩沖液到上面的緩沖液槽，小心操作勿將緩沖液滴到讀數的區域否則要再擦干凈并重新掃描。用IXTBE緩沖液灌上面的緩沖液槽直到高于最高的孔大約0.5 cm和距最上面的艙大約lcm，灌下面的緩沖液槽直到距離槽的頂大約1 cm。確保下面艙的電線是覆蓋著的，檢查上面緩沖液槽的墊圈是否密封好。 每臺儀器大約需要I.5L的1 X TBE。 10.用一個60 ml的注射器，用1 x TBE 沖洗膠孔。把針頭的頂部正好放在上面的緩沖液槽的兩塊玻璃板之間。 11.芒果需要，將一個塑料的指示帶放到玻璃板的外面，這樣相應的膠孔的順序可以顯示。檢查膠是否有斷掉的孔沿、氣泡或者壞的膠孔。注意如果有任何膠孔有這些問題都不能上樣。 12.將要上樣的板子放在冰盒里，將開始 4 列（A1~A4)的塑料封條扯掉。將微量移液器調到知 1，在孔 Al 里吸取樣本，將 tip 的平面放到兩塊玻璃板之間，大概—半伸入第一個膠孔里，緩慢的將樣本打入膠孔，拔出 tip。小心膠孔別太滿，防止樣本流入下一個膠孔里。如果相鄰的膠孔污染了，則跳過它，做個標記。 13.繼續從上樣板里吸取樣本上樣，直到 Hl 孔，然后移到下一列從 A2孔到 H2 孑 L。 將板子的前 4 列上到前三塊膠，如果膠上樣錯了，要在膠孔上注明上錯的那—道。 14.當膠全部上樣完了，把塑料指示帶從玻璃板上取下，插上上面和下面緩沖液槽子的電源，關上電泳艙的門。在373A 的測序鍵區，按下 ChooseRim 按鈕，選擇 GenescanRun開始電泳，立即用鼠標指示綠色的Coliect 按鈕開始 Genescan 收集。. Collect 按鈕將開始閃爍以核實收集開始，如果綠色的按鈕沒有開始閃爍，按下 373A鍵區的 StopRun 按鈕，從有經驗的人那里得到幫助。 15.重復第 9~14 步將 A4~H8 和 A9~H12 上樣到另外兩塊膠上，當所有的三個儀器全部上樣完成、Genescan 收集開始時，最后檢查收集的按鈕是否閃爍。當跑膠完成時，檢查錯誤。 Genescan 在收集過程中不應該有任何的錯誤，373 鍵區應該顯示執行時間用了 5.5 h。 16.關掉 373A 測序儀，打開電泳艙的門，拿住膠板，上緩沖液槽仍在上面，仍是對著激光室，打開兩邊的插銷將黑色的帶子從膠丄撕掉。將膠和上緩沖液槽一起拿出電泳艙，拿到水槽處倒掉緩沖液，將上緩沖液槽從膠上取下。 17.小心地將下緩沖液槽從電泳艙里取出倒掉緩沖液，沖洗兩個槽子后放到測序儀下面。用潮濕的紙巾將電泳艙內灑的液體擦干凈，關上電泳艙的門，其他的膠板重復此步驟。 18.分析股，根據生產廠家的說明書用 Genescan Analysis 和 Genotyper 軟件分析等位基因型。 展 | 
