色譜柱及填料介紹

高效液相色譜(HPLC)是一種現代分離、分析方法。20世紀60年代以來，HPLC作為一種分析技術在生命科學、環境科學、藥物分析等領域的應用日益普遍。其中色譜填料可謂是色譜技術的核心，它不僅是色譜方法建立的基礎，而且是一種重要的消耗品。色譜柱作為色譜填料的載體，當之無愧被稱為色譜儀器的“心臟”。高性能的液相色譜填料一直是色譜研究中最豐富、最有活力、最富于創造性的研究方向之一。 

　　近年來，液相色譜填料技術呈現二大趨勢。 第一個趨勢是快速液相，利用亞 2μm小粒徑硅膠、核殼型硅膠;第二大趨勢是越來越豐富的選擇性。下面就這二大趨勢做一個簡單介紹。

　　(一)快速液相色譜填料技術

　　硅膠基質的色譜填料因為其優異的色譜性能是目前應用最為廣泛的液相色譜填料，尤其是針對有機小分子的分離和分析，硅膠基質的色譜填料占據絕大多數的市場份額。最近10年，這個領域最激動人心的進展是基于以下二個方向的快速液相技術的發展。

1、超高效液相色譜(UHPLC)填料技術

　　從2004年Waters公司推出UPLC儀器，超高效液相色譜技術以其快速、高分離度和高靈敏度的優勢得到了廣泛的應用。而這種技術的核心是基于亞2μm小粒徑硅膠的色譜填料。當填料顆粒小于2μm時，不僅柱效明顯提高，而且隨著流速的增加，分離效率并不降低。采用高流速可將分離速度和峰容量擴展到一個新的極限，但同時柱壓也顯著升高。小粒徑填料需要使用壓力更高的超高效液相色譜儀系統，對色譜柱的生產工藝也有更高的要求，必須解決色譜柱的裝填難度大、柱頭容易漏液、填料容易堵塞等問題。目前，除了國際知名色譜儀器和色譜柱公司(如Waters、Agilent、Phenomenex)生產UHPLC色譜柱，國內的色譜柱廠家也陸續推出此類產品。雖然UHPLC儀器還是國際知名品牌壟斷市場的情況， 但是國產的UHPLC色譜柱已經可以取代進口品牌。 圖1為月旭公司Ultimate? XB-C18 UHPLC色譜柱(2.1×100mm, 1.8μm)對奶制品中黃曲霉毒素M1、M2測定的色譜圖。

2、核殼型色譜填料

　　核殼型(core-shell)色譜填料是由著名色譜科學家 Jack Kirkland 在2006年研制成功的一種新型色譜填料。它是將多孔硅殼熔融到實心的硅核表面而制備的。這些多孔的“光環”狀顆粒具有極窄的粒徑分布和擴散路徑，可以同時減小軸向和縱向擴散，允許使用更短的色譜柱和較高的流速以達到快速、高分辨率分離。并且，核殼型色譜柱所產生的反壓明顯低于UHPLC色譜柱，低反壓可以使儀器承受壓力降低，使得在常規的液相儀上就能夠實現超高效液相儀的分離效果。但是，核殼型色譜柱對儀器的柱外死體積要求高、且柱容量小于全多孔色譜填料，因而并不適用于大規模的制備液相分離需求。

　　過去3-5年全球的色譜研究人員發表了大量的有關核殼型色譜填料的學術文章，但是其在工業界的應用是一個漸進式推進的過程，不會一下子大面積被采用。國內還沒有報道有國內廠家生產核殼型填料。

(二)具有豐富選擇性的色譜填料

　　液相色譜技術的廣泛應用也得力于近年來各種色譜填料技術的發展為色譜分離提供了越來越多樣的選擇性。近年來人們制備了大量的含有不同鍵合基團的色譜填料以增強色譜柱的選擇性，從而滿足實際樣品分離的需要，例如親水作用色譜(HILIC)填料、立體保護鍵合色譜填料、極性嵌入反相色譜填料、有機-無機雜化色譜填料、親水性體積排阻色譜填料、混合模式色譜填料、手性色譜填料以及聚合物基質色譜柱填料等。

　　1、HILIC色譜填料。它采用極性固定相和含有一定水的水溶性有機溶劑為流動相，不僅克服了正相色譜和反相色譜對極性化合物分離的不足，而且提供了與反相色譜截然不同選擇性，在強極性和離子型化合物如氨基酸、碳水化合物和多肽等的分離中發揮著重要作用。并且，由于其流動相含有高濃度的有機溶劑，有利于增強電噴霧離子源質譜的離子化效率，進而提高其靈敏度，與質譜具有很好的兼容性。過去5-6年HILIC模式色譜柱的應用增長非常快。目前商品化的HILIC色譜填料種類繁多，基于硅膠基質的HILIC填料包括裸硅膠、氨基、氰基、二醇基、酰胺型以及兩性離子型等。目前生產HILIC色譜填料的國內公司主要有月旭、艾杰爾、迪馬以及賽分等公司。

2、極性嵌入反相色譜填料。它通過在硅膠鍵合烷基鏈的中下部鑲嵌一些極性基團，如烷基胺、酰胺、季銨或者氨基甲酸酯等極性基團來降低未反應硅醇基活性和改善對極性化合物的保留能力。這種填料具有的最大優勢是減少了填料表面游離硅羥基與堿性化合物間的“次級保留”作用，從而改善堿性化合物峰型的拖尾，而且由于極性基團的嵌入，增強了對極性化合物的保留，提供和普通C18很不一樣的選擇性。月旭公司的Ultimate? Polar-RP色譜柱裝填的即為該類型色譜填料。

　　3、立體保護鍵合相。它是在硅膠的烷基鏈側鏈鍵合含異丙基和異丁基的C18固定相。由于在C18烷基鏈上引入了較大的基團以及立體效應，阻礙了硅醇基與分析物的相互作用，因而對堿性化合物的分離呈現出對稱的峰型并具有良好的柱效，防止堿性化合物在色譜柱上的拖尾，并且在低pH值時有較高的水解穩定性。月旭Ultimate? LP色譜柱填充的即為此類型的色譜柱填料，特別適合在極低pH條件下(例如pH=0.8)分離極性化合物。此款色譜柱可以很好地取代市場上廣泛應用的安捷倫 Zorbax SB 色譜柱。

　　4、有機-無機雜化色譜填料。它是在超高純全多孔硅膠微球基質表面涂覆一層厚度均勻的有機-無機雜化層，進而提高填料的pH耐受范圍和應用能力的一種填料(其填料結構示意圖如圖4所示)。這種類型的填料能夠耐受pH值很高的流動相，并且具有很好的pH值穩定性，它的pH耐受范圍可以達到1.5-12，而常規的硅膠基質色譜填料pH值范圍一般僅為2-8;它能夠耐受各種緩沖液體系，柱壽命長。目前，月旭科技的Xtimate?反相填料、菲羅門公司的Gemini NX?均是屬于此類有機-無機雜化硅膠色譜填料。Waters 公司的X-Bridge 色譜填料采用的是其專有的有機-無機整體雜化技術，不是表面涂覆。

5、親水性體積排阻(SEC)色譜填料。它是在超高純全多孔硅膠表面包覆一層具有良好穩定性的親水性聚合物的體積排阻色譜填料，其填料的作用基團為二醇基(填料結構示意圖如圖5所示)。其填料表面因受二醇基官能團保護而不與蛋白質相互作用。使得蛋白、生物酶、多肽等樣品的非特異性吸附極小;因而廣泛應用于生物大分子的分離。月旭Xtimate? SEC填料即為此類型的色譜填料。目前已有120 ?、300 ?、500 ?和1000 ?等四種孔徑尺寸規格的SEC色譜柱產品。國內外也有一些色譜柱廠家成功研發了該類型產品，例如TOSOH公司的TSK gel SW-型色譜填料、安捷倫公司的ZORBAX GF色譜填料。

6、混合模式色譜填料。它是在一根色譜柱上實現兩種或多種分離機理共同主導的色譜柱填料。混合模式色譜分離的基礎是色譜固定相能同時提供多種作用力，如鍵合相同時包含烷基鏈和電荷中心，則可以提供疏水作用力和靜電作用力，實現反相和離子交換混合模式色譜分離。由于多種作用力的存在，混合模式色譜可以顯著地提高分離選擇性，這樣就可以實現根據樣品的不同特性進行分離。月旭公司目前具有多種混合基質的色譜填料，例如C18/SCX、C18/SAX等。圖7為月旭公司研發的C18/SCX色譜填料結構示意圖。

7、手性色譜填料。它是由具有光學活性的單體，固定在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相。通過引入手性環境使對映異構體間呈現物理特征的差異，從而達到光學異構體拆分的目的。一個有效的手性填料應當具有能夠快速分離對映體，測定對映體的純度，盡可能適應多種類型的對映體的分離;應當具有較高的對映體分離選擇性和柱容量。目前，手性填料主要有以下5大類: (1)多糖類手性色譜填料：主要包括纖維素和淀粉兩大類手性固定相;(2)大環手性色譜填料：主要是用大環分子和環糊精、手性冠醚來形成的固定相;(3)糖肽類手性固定相：主要是用萬古霉素、利福霉素B等制成的手性固定相;(4)多肽或蛋白質手性固定相;(5)配體交換手性固定相:建立在金屬配合物的配體交換的基礎之上的固定相。目前生產手性填料的國內外廠家有大賽璐、色譜科、菲羅門、廣州研創、月旭等公司。

　　8、最后，有機高分子基質液相色譜填料也是一個非常活躍的領域，主要分為多糖型基質填料和聚合物型基質填料。同硅膠基質的填料相比，此類填料具備高負載量、 高化學穩定性(耐酸 、耐堿、耐溶劑處理)，對于生物大分子不易產生不可逆的非特性吸附作用等優點。這些優點決定了其廣泛的應用前景，特別是生物大分子的分離和分析。一般來說，有機高分子基質色譜填料的柱效低于硅膠基質的填料。生產此類填料的國外廠家很多，例如GE、Tosoh (東曹)等，國內廠家這方面起步較晚，目前有納微、賽分和月旭等。

　　以上所述是色譜填料在技術方面的二大趨勢，現在我們再來看看色譜柱和色譜填料的市場趨勢。色譜柱的國內市場在過去的10年是一個快速發展的市場，這是因為色譜技術在國內的應用呈現了突飛猛進的勢頭。但是，色譜柱市場在發達國家是一個相對成熟和穩定的市場，雖然技術層面不斷有新的創新，但是新的技術的出現并不是一下子推翻以前的技術，Waters 公司的Symmetry 色譜柱已有20幾年的歷史了，但市場上還是很多人用它。各個廠家的市場份額也相對穩定，新的色譜柱公司基本沒有機會。國內市場不會馬上達到像歐美國家那種穩定的狀態，但是趨勢是競爭的門檻在提高。

　　一方面，和液相色譜儀相比，色譜柱這個細分產業是一個國內生產企業可以率先達到國際先進水平的行業，核心原因是色譜填料和色譜柱雖然也有較高的技術門檻，但是對專業的集成要求要低得多，主要是化學和材料，不需要機械、電子和軟件方面的專長。一些有較好研發基礎的廠家通過堅持不懈的努力和知識的積累，可以在幾年內達到國際先進水平。目前，月旭公司大量銷售的色譜柱產品主要的就是取代市場上知名國際品牌的產品。

　　另一方面，色譜工作者對色譜柱產品的要求越來越高，四、五百美元的色譜柱，相比它的重要性，大多數情況下價錢不是問題。用戶更關心的是色譜柱的重現性、壽命和選擇性，甚至高于對柱效、拖尾因子等純技術參數的關注。這就對廠家在產品質量管理和產品種類的豐富性方面提出了很高的要求。這二個方面都離不開產品研發能力和對色譜填料核心技術的掌握。產品質量方面，除了研發能力，還必須在各個生產環節，從原材料選材、鍵合工藝、裝柱工藝到色譜柱出廠質量檢測都要進行嚴格的控制。

　　除了產品質量和產品種類，色譜柱廠家還要在色譜方法開發方面持續地進行投入，客戶對色譜柱品牌的選擇有一定的粘性，最有效的營銷是靠應用去替換。客戶不缺色譜柱，缺的是色譜分離分析的解決方案。注重應用開發的色譜柱廠家才能成為行業內公認的“色譜專家”，才能贏得客戶的認可。