色譜法(層析法)基本原理(2)

取適當的色譜濾紙按纖維長絲方向切成適當大小的紙條，離紙條上端適當的距離（使色譜紙上端能足夠浸入溶劑槽內的流動相中，并使點樣基線能在溶劑槽側的玻璃支持棒下數厘米處）用鉛筆劃一點樣基線，必要時色譜紙下端可切成鋸齒形，以便于流動相滴下。 將試樣溶于適當的溶劑中，制成一定濃度的溶劑。用微量吸管或微量注射器吸取溶劑，點于點樣基線上，溶液宜分次點加，每次點加后，俟其自然干燥、低溫烘干或經溫熱氣流吹干。樣點直徑一般不超過0.5cm，樣點通常應為圓形。

將點樣后的色譜濾紙上端放在溶劑槽內，并用玻璃棒壓住，使色譜紙通過槽側玻璃支持棒自然下垂，點樣基線在支持棒下數厘米處。色譜開始前，色譜缸內用各單體中所規定的溶劑的蒸氣飽和，一般可在色譜缸底部放一裝有流動相的平皿，或將浸有流動相的濾紙條附著在色譜缸的內壁上，放置一定時間，俟溶劑揮發使缸內充滿飽和蒸氣。然后添加流動相，使浸沒溶劑槽內濾紙，流動相即經毛細管作用沿濾紙移動進行展開至規定距離后，取出濾紙，標明流動相前沿位置，俟流動相揮散后按規定方法檢出色譜斑點。

2、上行法 色譜缸基本和下行法相似，唯除去溶劑槽和支架，并在色譜缸蓋上的孔中加塞，塞中插入玻璃懸鉤，以便將點樣后的色譜濾紙掛在鉤上。色譜濾紙一般長約 25cm，寬度則視需要而定。必要時可將色譜濾紙卷成筒形。點樣基線距底邊約2.5cm，點樣方法與下行法相同。色譜缸內加入適量流動相，放置，俟流動相蒸氣飽和后，再下降懸鉤，使色譜濾紙浸入流動相約0.5cm，流動相即經毛細管作用沿色譜濾紙上升，除另有規定外，一般展開至15cm后，取出晾干，按規定方法檢視。

色譜可以向一個方向進行，即單向色譜；也可進行雙向色譜，即先向一個方向展開，取出，俟流動相完全揮發后，將濾紙轉90°，再用原流動相或另一種流動相進行展。亦可多次展開，連續展或徑向色譜等。

薄層色譜法

按各單體所規定的載體，放入適當容器，加入適量水以配成懸浮液，在厚度均勻一致的50×200mm或200×200mm平滑玻璃板上將此懸浮液均布成 0.25mm的厚度，風干后一般在110度下干燥0.5-1h（或按單體規定）。

以離薄層板一端約25mm的位置作為點樣基線，用微量吸管按規定量吸取試樣液和對照（標準）液，點于基線上，點與點之間的距離在10mm以上，液點的直徑約3mm，風干后，基線一端向下，將薄層板放入展開溶劑，溶劑層深10mm，并預經開展溶劑的蒸汽飽和。在展開溶劑從基線上升至規定距離（一般為15cm）后，取出薄層板，風干，然后按規定的方法，對斑點的位置和顏色進行檢查。

氣相色譜法

氣相色譜法是在以適當的固定相做成的柱管內，利用氣體（載氣）作為移動相，使試樣（氣體、液體或固體）在氣體狀態下展開，在色譜柱內分離后，各種成分先后進入檢測器，用記錄儀記錄色譜譜圖。 在對裝置進行調試后，按各單體的規定條件調整柱管、檢測器、溫度和載氣流量。進樣口溫度一般應高于柱溫30-50度。如用火焰電離檢測器，其溫度應等于或高于柱溫，但不得低于100度，以免水汽凝結。色譜上分析成分的峰的位置，以滯留時間（從注入試樣液到出現成分最高峰的時間）和滯留容量（滯留時間×載氣流量）來表示。這些在一定條件下，就能反應出物質所具有特殊值，并據此確定試樣成分。

根據色譜上出現的物質成分的峰面積或峰高進行定量。峰面積可用面積測定儀測定，按半寬度法求得（即以峰1/2處的峰寬×峰高求得）。峰高的測定方法是從峰高的頂點向記錄紙橫座標準垂線，找出此垂線與峰的兩下端聯結線的交點，即以此交點至峰頂點的距離長度為峰高。

定量方法可分以下三種：

1、內標準法 取標準被測成分，按依次增加或減少的已知階段量，各自分別加入各單體所規定的定量內標準物質中，調制標準溶液。分別取此標準液的一定量注入色譜柱，根據色譜圖取標準被測成分的峰面積和峰高和內標物質的峰面積和峰高的比例為縱座標，取標準被測成分量和內標物質量之比，或標準被測成分量為橫坐標，制成標準曲線。

然后按單體中所規定的方法調制試樣液。在調制試樣液時，預先加入與調制標準液時等量的內標物質。然后按制作標準曲線時的同樣條件下得出的色譜，求出被測成分的峰面積或峰高和內標物質的峰積或峰高之比，再按標準曲線求出被測成分的含量。

所用的內標物質，應采用其峰面積的位置與被測成分的峰的位置盡可能接近并與被測成分以外的峰位置完全分離的穩定的物質。

2、絕對標準曲線法 取標準被測成分 按依次增加或減少階段法，各自調制成標準液，注入一定量后，按色譜圖取標準被測成分的峰面積或峰高為縱座標，而以標準被測成分的含量為橫坐標，制成標準曲線。然后按單體中所規定的方法制備試樣液。取試樣液按制標準曲線時相同的條件作出色譜，求出被測成分的峰面積和峰高，再按標準曲線求出被測成分的含量。 3、峰面積百分率法 以色譜中所得各種成分的峰面積的總和為100，按各成分的峰面積總和之比，求出各成分的組成比率。

氣液色譜法

這時所指的氣液色譜法，主要用于各種香料物質的分析，基本條件和參數主要依照美國精油協會（EOA）于 1979年所建議的方法。其基本原理、操作、標準狀態等均與上述氣相色譜法相同。

1、柱 用304號合金所制不銹鋼管，長3m，內徑2.16-2.57mm，外徑3.18mm。底物：極性柱為聚乙二醇20M（Carbowax 20M）,分子量約2萬；非極性柱為氣相色譜級甲基硅氧烷（SE-30），或二甲基硅氧烷（OV-1或OV-101）。底物濃度：重量的105。固體載體：10目或20目熔融煅燒過的硅藻土，經硅烷化和酸洗后，其自由傾落密度為0.2g/cm3，最小120目，最大80目。裝填密度每cm3應大于 0.24g。

2、載氣 氦。最低流量為每分鐘25-50ml。

分析狀態
極性柱：起始溫度，最低75度；最終溫度，最高225度。升溫速度，每分鐘2-8度。
非極性柱：起始溫度，最低75度；最終溫度，不超過275度；升溫速度，每分鐘2-8度。
進樣溫度：225-250度。試樣量：0.1-1ul。

檢測器：用熱導池。檢測器的操作條件應維持恒定。