色譜質譜聯用技術

　　色譜質譜聯用技術

　　一、聯用技術的必要性

　　每種分析方法都有其特長和局限性。在線聯用不僅能取長補短，而且還具有協同作用，獲得兩種技術單獨使用時所不具備的某些功能。

　　色譜用于分離，而光譜用于結構鑒定，兩者聯用，不僅可以對混合物中的各未知組分進行定性，也可用于定量分析。

　　二、氣相色譜－質譜聯用(GC-MS)

　　1、GC-MS-Computer的工作過程：

　　GC：各組分被色譜柱分離，隨時間變化依次從柱子流出，通過接口進入MS

　　MS：連續掃描MS圖，每掃描一張MS圖需花費約零點幾到幾秒鐘。總掃描時間＝(掃一張圖譜的時間)×掃描次數

　　計算機：將得到的所有MS數據存儲起來，供下一步的處理和輸出。

　　2、氣質聯用系統提供的信息

　　（1）總離子流圖（TIC）：

　　質譜儀檢測到的所有離子信號（不分其質荷比）的總和對時間t作圖；

　　相當于氣相色譜圖。沒有組分通過時為基線；當組分流出時，即出現峰。

　　注：TIC圖中的每一個峰代表一個組分；峰的位置就是該組分的色譜保留時間；峰面積與組分的相對含量有關。

　　（2）每個組分的質譜圖：

　　可從質譜圖獲得組分的分子量和分子結構信息。

　　譜庫檢索：根據NIST，INCOS，PBM三種算法，將未知物圖譜與譜庫中的標準圖譜比較，匹配度越高，可信度越高

　　（3）質量色譜圖（提取離子流圖）

　　以指定質荷比的離子強度（而不是總的離子流強度）對時間t（或掃描號）作圖。

　　是計算機進行數據處理得到的圖。

　　優點：可在復雜混合物的TIC圖中,迅速找到所需檢測的化合物或同系物。

　　3、GC-MS的應用

　　A環境污染物的分析

　　B香精、香料的成分分析和質量評價

　　C中草藥的揮發性成分鑒定

　　D藥物及其他化工產品的分析

　　E毒物、毒品及違禁藥物的鑒定和檢測等等

　　三、液相色譜-質譜聯用技術(LC-MS)

　　1、液質聯用與氣質聯用區別

　　氣質聯用儀(GC-MS)是最早商品化的聯用儀器，適宜分析小分子、易揮發、熱穩定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標準譜庫對比。

　　液質聯用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。

　　2、常見術語

　　質荷比: 離子質量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,寫作m/z.

　　峰: 質譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰.

　　離子豐度: 檢測器檢測到的離子信號強度.

　　基峰: 在質譜圖中，指定質荷比范圍內強度最大的離子峰稱作基峰.

　　總離子流圖；質量色譜圖；準分子離子；碎片離子；多電荷離子；同位素離子

　　3. 如何看質譜圖：

　　(1)確定分子離子,即確定分子量

　　氮規則：含偶數個氮原子的分子，其質量數是偶數，含奇數個氮原子的分子，其質量數是奇數。

　　(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學式

　　高分辨質譜可以由分子量直接計算出化合物的元素組成從而推出分子式

　　低分辨質譜利用元素的同位素豐度，

　　(3)峰強度與結構的關系

　　豐度大反映離子結構穩定

　　在元素周期表中自上而下，從右至左，雜原子外層未成鍵電子越易被電離，容納正電荷能力越強，含支鏈的地方易斷，這同有機化學基本一致，總是在分子最薄弱的地方斷裂。

　　(4)質譜解析的一般步驟

　　適于低分辨小分子譜圖,若已經是高分辨質譜圖得到元素組成更好

　　(a)核對獲得的譜圖,扣除本底等因素引起的失真,考慮操作條件是否適當

　　(b)綜合樣品其他知識：例如熔點，沸點，溶解性等理化性質，樣品來源，光譜，波譜數據等.

　　(c) 盡可能判斷出分子離子。

　　(d) 假設和排列可能的結構歸屬：高質量離子所顯示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味著失H，CH3，H2O，HF，OCH3......

　　(e)假設一個分子結構，與已知參考譜圖對照，或取類似的化合物，并作出它的質譜進行對比。

　　4. 離子源

　　EI(Electron Impact Ionization):電子轟擊電離—硬電離。

　　CI(Chemical Ionization):化學電離—核心是質子轉移。

　　FD(Field Desorption):場解吸—目前基本被FAB取代。

　　FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轟擊—或者銫離子(LSIMS,液體二次離子質譜 ) 。

　　ESI(Electrospray Ionization):電噴霧電離—屬最軟的電離方式。適宜極性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白質分子多肽等)

　　APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大氣壓化學電離—同上，更適宜做弱極性小分子。

　　APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大氣壓光噴霧電離—同上，更適宜做非極性分子。

　　MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基體輔助激光解吸電離。通常用于飛行時間質譜和FT-MS，特別適合蛋白質，多肽等大分子．

　　5定性分析流程

　　在考慮使用質譜儀（MS）之前，應當考慮分析工作的類型、預期獲得的結果等：

　　定性分析準備工作

　　了解樣品其他知識，如熔點，沸點，溶解性等理化性質，合成路線，光譜，波譜數據等；可能含有的雜質，樣品大致含量等；進行LC-MS分析前最好確定LC條件，能夠基本分離，流動相緩沖體系符合MS要求；色譜柱和管路的清洗：某些樣品非常容易吸附在進樣閥和管路中，尤其是采用針泵進樣時，應先用空白溶劑充分清洗管路。

　　如原來溶解樣品的溶劑,若不合適LC-MS,N2吹干,再用流動相定量溶解。溶解樣品的溶劑和流動相不一致，得到的譜圖不純，峰形不好，變寬，出怪峰；

　　某些固體直接用流動相不溶，可以先加一滴DMSO，再加甲醇或乙腈等稀釋；

　　進樣順序要先稀后濃，定量溶解，濃度控制在幾個ppm級，不然易污染系統，造成本底太高影響分析結果。

　　色譜柱選擇

　　選擇原則:定性可長些,能夠基線分離最好，若做不到，可以通過提取離子EIC來得到較好的色譜圖。內徑無要求，粗細均可；

　　一些特殊的化合物必需使用特殊的色譜柱進行分離，相關的知識可以向色譜柱供應商索取。

　　大多數著名的色譜柱廠商都有自己的色譜柱分析數據庫，里面可能會有想要的信息。

　　正、負離子模式的選擇

　　正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優先考慮使用正離子模式；負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強負電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。

　　流動相的選擇

　　常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調節pH值。

　　LC／MS接口避免進入不揮發的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須＜lmmoL/L。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸銨＜10一5 mmol/l。

　　送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。

　　6影響分子量測定的因素

　　1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負離子方式pH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形。

　　2）氣流和溫度：當水含量高及流量大時要相應增加。

　　3）溶劑和緩沖液流量：流速適當高可以提高出峰的靈敏度。

　　4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負離子乙腈好些

　　5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱

　　6）合適的電壓：DP電壓高時，樣品在源內分解或碎裂；高DP電壓時回使多電荷離子比例低，多聚體也減少

　　7）樣品結構和性質

　　8）雜質的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當成分復雜，雜質太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好

　　9）樣品濃度不夠，有時需要濃縮

　　7 應用領域

　　醫藥學：藥物代謝、藥物動力學、雜質分析、天然產物分析

　　生物化學：肽、蛋白質、寡核苷酸、糖

　　環境化學：農藥和農殘分析、有機污染物、土壤/食品/水分析

　　臨床醫學：新生兒檢查、糖化血紅蛋白（糖尿病）、血紅蛋白變異、膽酸

　　食品科學：香料、添加物、包裝物、蛋白質、致癌物

　　法醫學：濫用藥物、爆炸物、興奮劑檢測

　　獸醫學：興奮劑、磺胺類藥物、抗體

　　合成化學：有機金屬化合物、有機合成物

　　有機化學：表面活性劑、染料