試劑、試劑盒 DEAE 纖維素 二乙醇胺 (TEA) 溶液 0.lmol LTEA 緩沖液 0.lmol L 氯化鈉含 0.lmoi. LTEA 緩沖液 12mol L 氯化鈉含 0.lmol LTEA 緩沖液 lmol L 氯化鈉含 0.lmol LTEA 緩沖液 乙醚 水飽和酚 乙醇
儀器、耗材 皂土電動攪拌器 離心機 部分收集器 紫外分光光度計
實驗步驟
一 材料與設備
1)DEAE 纖維素：稱取 20 g 交換量 l.Ommol/gDEAE 纖維素，先用 300 ml0.5mol/L 氫氧化鈉浸泡 1?2 h 攪拌, 傾去上清液后水洗至中性。
2) 二乙醇胺 (TEA) 溶液：先用濃 HC1 調至 pH7.4, 然后稀釋成 lmol/L 作為儲液。
3)0.lmol/LTEA 緩沖液 (pH7.4)
4)0.lmol/L 氯化鈉含 0.lmoi./LTEA 緩沖液，pH7.4,
5)12mol/L 氯化鈉含 0.lmol/LTEA 緩沖液，pH7.4。
6)lmol/L 氯化鈉含 0.lmol/LTEA 緩沖液，pH7.4。
7) 乙醚。
8) 水飽和酚。
9) 乙醇，
10) 皂土
11) 電動攪拌器。
12) 離心機，
13) 部分收集器。
14) 紫外分光光度計。
二 操作方法
1)250 g 新鮮面包酵母，加入 375 ml 蒸餾水，攪勻成糊狀。
2) 再加入 500 ml90% 苯酚（改變細胞透性，使蛋白變性），電動攪拌 lh 后，放置于冰箱中過夜。
3)4000r/min 離心 15 min, 棄去上清液，下層為酚相，小心吸出后 (避免吸入蛋白質），每升加 20 g 乙酸鉀和 2L 乙醇使 tRNA 沉淀，-20°C 過夜。
4)4000r/nin 離心 15 min。棄去上清液，沉淀用 95% 乙醇洗一次，4000r./min 離心15 min
5) 沉淀再用乙醚洗一次，4000r/min 離心 15 min
6) 沉淀溶于 25 ml0.1mol/LTEA 緩沖液中. 加入 0.025 g 皂土，1.5 g 氯化鈉，0°C 靜置 lh，4000r/min 離心 15 min。
7) 上清液用 0.1mol/I.TEA 緩沖液稀釋 10 倍，上樣到已用的含 0.lmol/LNaCl 的0.lmol/LTEA 緩沖液平衡的 DEAE 纖維素柱. 用含 0.2mol/LNaCl 的 TEA 洗滌，至流出液的 OD260<0.05 為止。
8) 用含 1mol/LMaCl 的 TEA 洗脫，分部分收集, 測定其 OD260，取其峰值部分的液體
9) 加 2 倍體積 95% 乙醇，一 20℃ 過夜（或 2 h)
10)4000r/min 離心 15 min。上清液棄去，沉淀以 67% 乙醇，95% 乙醇，無水乙醇及乙醚各洗一次。
11)4000r/mim 離心, 沉淀真空干燥，電泳檢測 tRNA,