苯酚法提取酵母RNA實驗原理和操作步驟

（一）原理
細胞內大部分RNA 均與蛋白質結合在一起，以核蛋白的形式存在。因此，提取RNA時要把RNA與蛋白質分離并除去。將細胞置于含有十二烷基磺酸鈉（Sodium dodecyl sulfate,SDS）的緩沖液中，加等體積水飽和酚，通過劇裂振蕩，然后離心形成上層水相和下層酚相。核酸溶于水相，被苯酚變性的蛋白質或者溶于酚相，或者在兩相界面處形成凝膠層。
本實驗采用的0.15mol/L 緩沖液系統可使大部分RNA-蛋白復合物解離，而DNA-蛋白復合物只有極少部分解離；用酚處理時DNA-蛋白復合物變性，在低溫條件下從水相中除去，這樣得到的RNA 制品中混雜的DNA 極少。用氯仿-異戊醇繼續處理RNA 制品，可進一步除去其中少量的蛋白質。最后用乙醇使RNA 從水溶液中沉淀出來。本法得到的RNA 不僅純度高，而且多呈自然狀態，可供繼續研究之用。
（二）主要儀器和試劑
1．儀器
（1）臺式高速離心機（10 000r/min）
（2）水浴
（3）Eppendorf 管（1.5mL）
（4）紫外可見分光光度計
（5）冰箱或冷柜（0～4℃）
（6）振蕩器
（7）分析天平（精確至0.1mg）
（8）真空干燥器
 2．試劑（均為分析純）
（1）SDS- 緩沖液：0.3％ SDS，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L 乙酸鈉，用乙酸調到pH5.0。
（2）飽和酚液：重蒸苯酚用（1）溶液飽和。
（3）氯仿-異戊醇液：24﹕1（V/V）。
（4）含2％乙酸鉀的95％乙醇溶液。
（5）無水乙醇
（6）乙醚
（7）溶菌酶（B.R.）（1mg/mL）
（三）操作步驟
1．取1g 活性干酵母在研缽中研碎，加10mL SDS-緩沖液使成勻漿，洗入各Eppendorf管（略少于管容積的一半），加溶菌酶0.1mL，混勻，室溫靜置10min，再加等體積飽和酚液，室溫下劇烈振蕩5min。
2.置冰浴中分層，在0～4℃低溫環境下，10 000r/min 離心10min。吸出上層清液，轉入新的Eppendorf 管，加等體積氯仿-異戊醇，室溫下劇烈振蕩2.5min，然后10 000r/min 離心5min。

3.吸出上層清液，轉入另一新Eppendorf 管，加2 倍體積95％乙醇（含2％乙酸鉀），在冰浴中放置30min，使RNA 沉淀。
4.再以10 000r/min 離心5min，棄上清液，沉淀用少許無水乙醇和乙醚各洗一次，即加乙醇或乙醚，迅速離心各1min，保留沉淀。
5.傾去乙醚后，減壓真空干燥，準確稱重，記錄。
6.RNA 制品純度的測定及RNA 提取率的計算與濃鹽法相同。