1.從配有 18 1/2 G 針頭的 10ml 注射器中滴入外周血（18~25 滴；0.4~0.5 ml) 至已盛有 10ml RPMI/15% FBS 完全培養基的 25 cm2 組織培養瓶中。配置兩份培養基為 DEB 研究，兩份作為未處理對照（共 4 份）。孵化培養基 24 h(附錄 31)。 2.分裝 PBS 至 3 個 15 ml 離心管中：第 1 管 10 ml，第 2 管 6 ml，第 3 管 4.5 ml。 3.在加培養基之前，先加 10 ul 常用的 DEB 至第 1 管，加蓋，混勻。從第 1 管中轉移 4 ml 至第 2 管，加蓋，混勻。從第 2 管中轉移 0.5 ml(500ul) 至第 3 管，加蓋，混勻。 4.從第 3 管中各取 25 u1 溶液加入兩個已孵化了 24 h 的外周血培養基中（從第 1 步；培養瓶中的最終濃度為0.l ug/ml。）。再孵化 48~72 h。 5.每 10ml 培養基中各加人 1ul/ml 的秋水仙胺 2 ml，孵化 20 min。 6.將每個培養基培養瓶中的液體轉移到 15 ml 圓錐形底部的離心管中，加蓋，150 g 離心 10min。 7.去掉大部分上清液，用手指輕彈離心管，使剩余上清中的片狀沉淀物重新處于懸浮狀態，小心地加人預熱的 0.075mol/L Ka5 ml，使細胞膨脹，但不要使其破裂。在 37°C 水浴槽中孵化 10 min。室溫，150 g 離心 10 min。 8.去掉上清，輕輕地加入 1 ml 新鮮的固定劑，不要把沉淀沖起來。去掉固定劑，重復這一步。 9.立即用食指彈擊管壁幾次，使片狀沉淀物碎裂。迅速加入固定劑使細胞懸浮，防止其成塊。終體積為 8~10ml。用 Pasteur 移液管打散團塊。室溫靜置 30 min。 10.室溫，150 g 離心 lOmin。去掉上清，留下 3~5 ml，使片狀沉淀物懸浮。室溫靜置 lOmin。可立即重復這一步一次或兩次，也可以讓固定劑中的細胞在室溫下過夜以后進行。 11.室溫，150 g 離心 lOmin。去掉上清，打散沉淀，加入適量的固定劑（0.25~0.5 ml)，使其達到一個理想的濃度用于制片。 一個理想的細胞濃度能使絕大部分細胞在一個顯微視野中，沒有擁擠的中期伸展。
12.從一個適當的高度，滴下幾滴細胞懸液于清潔的玻片上，使中期分裂相能很好地散布（單元 4.1)，一瓶培養基最少要制作 6 塊玻片（推薦使用非診斷用的細胞去練習)。 這一步是成功的關鍵。
13.在倒置顯微鏡下觀測玻片，確定中期分裂相的質量和數量。用吉姆薩將玻片染色 (支持方案 2)。 14.每一個 DEB 處理的標本分析 50~100 個用吉姆薩染色的中期分裂相（對于高度斷裂的情況分析 25 個中期分裂相；附錄 3K)。對染色體進行計數，并記錄結構異常的染色體的數目和類型。如果斷裂的染色體超過了上面的正常范圍，分析未處理的標本。分析完成后對異常的細胞進行照相。 15.根據已出版的結果作為基礎和 PHA 刺激下，夕卜周血淋巴細胞中 DEB 誘導染色體斷裂情況下解釋結果。 表 8.7.1 顯示了從正常和受影響的個體中得到的基線和處理培養數據
 支持方案 1 二氧橋丁烷的使用和處理DEB(1，3-雙環氧丁烷）為潛在的致癌物質，處理這種化合物時，必須采取一些防范措施。這一部分闡述的是如何使用和恰當地處理廢物。 工作空間。凡用到 DEB 的操作必須在化學通風櫥或者 n 級生物學安全工作櫥中完成。在使用 DEB 時要穿實驗工作服和戴手套。手上隨時準備一瓶 6mol/L HCl(50 ml)，一旦 DEB 不小心倒出來馬上將其滅活。 細胞培養。有 DEB 參與的細胞培養操作應該在 n 級生物學安全工作櫥中完成。細胞被固定后，操作就可以在安全櫥外進行了。用 6mol/LHCl 處理廢棄的培養基和清洗液，并視其為危險生物廢物。以前使用過的移液管和培養瓶應該用 6mol/L HCl 沖洗，并放在高壓危險生物袋中。微量移液吸頭也應該丟在盛有 6mol/L HCl 的小瓶內。 廢物處理。DEB 原液應該當作危險的化學廢物來處理，而不能采用稀釋或化學滅活的方法。使用過的塑料器具應該用 6md/LHCl 沖洗并丟入高壓危險生物袋中。培養基和清洗液也應該用 6mol/LHCl 處理，并作為危險生物廢物來處置。 支持方案 2 用于染色體斷裂分析的吉姆薩染色吉姆薩染色是一種組織學染色，對細胞核和染色體有特別的親和力。制作簡單，使未顯帶的細胞核和染色體成微紅色到紫色。 1.將一片 pH6.8 的 Gurrs 緩沖液溶于 1L 水中。 2.加入 4 ml 新鮮的吉姆薩染液至盛有 46 mlGunrs 緩沖液的染缸中。染液可使用 1h 或染 20 塊玻片，然后就要配置新的染液。 3.將中期染色體玻片染色 5 min。在盛有 Gurrs 緩沖液的染缸中浸洗幾次（第 1 步)。 4.在盛有水的染缸中浸洗幾次。空氣中干燥，檢查玻片的染色強度。 染色強度應該足量，而染色體上的裂痕和斷裂區又不易染色（非染色）。 5.使用 Permount 組織封固劑將蓋玻片加載于載玻片上。 備選方案 1 成纖維細胞培養二氧橋丁烷試驗如果外周血不能獲取，可以通過皮膚組織活檢成纖維細胞培養來進行試驗。也可以從流產兒或死產兒中取幾小片肺組織或皮膚來進行試驗。因為較高濃度對 FA 成纖維細胞有太大的毒性，很難收獲足夠多的中期分裂相來進行研究。 1.將 0.5 ml DMEM 完全培養基/20% FBS 溶液中的活體組織放于一塊 60 mm 組織培養皿上，并用無菌手術刀將其切割成片，1 mm 大小。 2.另取最少三塊 60 mm 組織培養皿，用無菌手術刀尖在皿底劃上幾條水平線和垂直線。滴幾滴 DMEM 完全培養基/20% FBS 溶液至活體組織片上。在每個 60 mm 組織培養皿上用無菌 Pasteur 移液管放上 5 或 6 片活體組織。將組織放在水平線和垂直線的交叉點上。 3.孵化培養皿，不要加任何其他組織培養基，15~30 min，使組織片黏附在皿上。加 5 mlDMEM 完全培養基/20% FBS 溶液至每塊培養皿中，孵化培養基。 4.每 3~4d 更換一次培養基，但不要擾亂組織片。使用倒置顯微鏡觀察培養基中細胞的生長狀況（得花上 1 周至 1 月才能觀察到生長較好的細胞）。 5.當培養皿中的組織片周圍能看到大片的成纖維細胞時，用 1X 胰島素/EDTA/15% FBS 處理細胞，進行傳代（附錄 31)，注意當活體組織能夠繼續在培養基中生長時不要將它們取出來。將細胞轉移至盛有 DMEM 完全培養基/15%FBS 的 25 cm2 無菌組織培養瓶內。 6.當第一代細胞長滿后，再次用胰蛋白酶處理（附錄幻）。次代培養按1：3 分裝至 DMEM 完全培養基/15% FBS 溶液中。為 FA 患者進行 DEB 試驗時，至少有兩個第二代培養基中長滿細胞。 7.用 5 ml DMEM 完全培養基/15% FBS 溶液將細胞接種在 25 cm2 培養瓶中，使每個培養瓶中細胞的密度達到 3X105 個細胞（為本次檢驗準備兩個處理的和未處理的對照培養瓶）。孵化 24 h。 8.將 DEB 按以前所描述的那樣稀釋（基本方案，第 2~3 步），再增加第 4 管，分裝 PBS 4.5 ml。成纖維細胞培養還要增加最后一步稀釋，即從第 3 管中取出 0.5 ml(500ul 加入第 4 管中。 9.從第 4 管取出 254 加入到 10ml 新鮮的 DMEM 完全培養基/15% FBS 溶液中。 10.培養細胞直至細胞接近長滿（約 72 h)。 11.胰酶消化細胞（附錄 31) 按 1:2 或 1:3 傳代到新鮮的完全 DMEM/15%FBS 培養基。該培養基不含 DEB 用于收集充足的有絲分裂細胞來進行細胞遺傳研究。重新加入限制性培養基，該培養基含有鮮好、稀釋的 DEB。 12.于第一個有絲分裂時段收集培養的細胞（傳代 24~48 h; 這時細胞處于有絲分裂中期附近），在收集細胞前 3 h，加入 1ml 濃度為 1ug/ml 的秋水仙胺到 DEB 處理的細胞中，同時用未用 DEB 處理的細胞作對照（于 5 ml 培養基）。 13.用胰酶消化細胞，將培養瓶內的液體轉移至 15 ml 無菌的離心管，加蓋，150 g 離心 10min。 14.去掉大部分上清，使剩余上清內的沉淀重新懸浮，并慢慢加入 0.051mol/L 的 KCl 5 ml。在 37°C 水浴箱中孵化 lOmin。離心 lOmin。 15.像前面敘述的那樣將細胞固定在預備好的載玻片上（基本方案，第 9~12 步；在第 9 步，緩慢加人 3~5 ml 固定液)。 16.檢驗 100 個未處理和 DEB 處理后吉姆薩染色的中期分裂相細胞，找斷裂染色體，方法如前所述（基本方案，第 13 步，支持方案 2)。根據在 FA 患者成纖維細胞中為基線和 DEB 誘導的染色體斷裂所建立的評估來解釋結果。 備選方案 2 范可尼貧血二氧橋丁烷產前診斷試驗FA 可以在妊娠時診斷，但有一定風險，在懷孕 9~12 周時通過培養絨毛絨膜取樣 (chorionic villus sampling,CVS) 獲得滋養層細胞或者在 15~17 周時羊膜穿刺獲得羊水細胞進行研究。FA 也可以用胎兒血液進行產前診斷，方法與以前的外周血培養相同。 研究 CVS 或羊膜穿刺獲得的胎兒細胞1.在 25 cm2 的培養瓶內配置胎兒細胞培養基（單元 8.1 和單元 8.2)。 2.當培養瓶內有幾個大的、生長迅速的克隆時，不要讓克隆過度的生長，用胰酶消化細胞，按 1:2 或 1:3 進行首次傳代培養（附錄 31)。孵化 24 h。 3.用自有 0.01 ug/ml DEB 的新鮮生長培養基置換生長培養基（從兩個不同的首次傳代培養基中）至最少兩個培養瓶中。可能的話，用含0.1ug/ml DEB 的培養基置換首次傳代的培養基至另外兩個培養瓶中，稀釋與以前相同（備選方案丨，第 8~9 步)。 剩余培養瓶中的液體作為染色體斷裂研究基線的未處理對照。
4.孵化培養基，收獲并固定細胞，如之前敘述的那樣準備中期染色體涂片（備選方案 1，從第 10 步開始)。 5.每組共檢測 100 個中期分裂相（基線組，DEB 處理組；每組分別從兩個首次傳代培養瓶中各取 50 個中期分裂相）。根據針對通過 CVS 或羊膜穿刺獲得的 FA 胎兒細胞所制定的基線和 DEB 誘導的染色體斷裂所建立起來的評估來解釋結果。 展開 | 
