草魚出血病II型病毒(GCRV II)核酸檢測試劑盒（一管式恒溫熒光法）使用說明
◆ 產品說明
動物疫病檢測系列基于獨特的恒溫熒光檢測技術，可針對食品、動物組織等樣品中病毒的特異核酸片段進行擴增，通過實時擴增曲線判定結果。本產品用于對草魚出血病II型病毒（GCRV II）的檢測，檢出限為103copies/μl基因組RNA。
◆ 產品組成（96測試）
032201LⅢ | |
試劑 | 含量 |
A-GCRV II-I | 22μL× 96管 |
B-I | 90 μL × 2支 |
R-I | 12 μL × 2支 |
NG-I | 50 μL × 3支 |
PG-GCRV II-I | 50 μL × 2支 |
◆ 適用儀器
Dhelix-C、ESE Tube Scanner、Genie II、Deaou-308C等恒溫熒光檢測儀，ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等熒光PCR儀。
◆ 自備耗材和儀器
①滅菌1.5mL或2.0mL離心管；②冰盒；③移液器（0.1-2.5μL，0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④離心機；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴
◆注意事項
1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區操作。
1）第一區：樣本制備區。
2）第二區：模板添加區。
3）第三區：擴增及產物分析區。
★分區之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。
2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。
3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。
4．反應液中的成分對光敏感，應避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應避免反復凍融，推薦使用前離心30秒。
5．反應結束后，擴增管請置于密封袋內丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。
6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內使用。
◆ 樣品處理
參照《SN/T 3584-2013 草魚出血病檢疫技術規范》或其他標準處理樣品，制備的樣本保存待用。
詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。
◆ 實驗操作
1. 模板制備（樣本制備區）
建議使用配套水生動物病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產品，具體過程詳見產品說明書。
2．添加模板（模板添加區，放置于冰盒中進行）
取出所需測試數的已含有反應液的PCR管，將試劑完全解凍，解凍后打開管蓋向各管管底分別加入0.8 μL B-I及0.2μL R-I，蓋上管蓋離心1 min。打開管蓋分別沿各管管壁上加入2μL模板，順序為NG-I、待測樣品模板、PG- GCRV II -I。蓋好PCR管蓋后，離心3 min，立即進行PCR擴增反應。
3. 擴增反應（擴增及產物分析區）
①恒溫儀器63℃條件下反應45 min。
②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃ 15 s，63℃ 45 s作為一個循環，于63℃ 45 s處收集熒光信號，45個循環。
其他儀器請參照儀器說明書進行設置。
◆ 結果判定
①儀器自動判定結果，若顯示“陽性”，則樣品中含有草魚出血病II型病毒（GCRV II）；若顯示“陰性”，則樣品中不含有對草魚出血病II型病毒（GCRV II）或含量低于檢出限。如在40min~45min間出現曲線上揚而自動判讀結果為陰性，可能由于樣品含量較低導致，建議對樣品進行富集或延長反應時間至60min進行復核。
②在熒光定量PCR儀上，根據有無“S”型擴增曲線判定結果。若有“S”型擴增曲線，則樣品中含有草魚出血病II型病毒（GCRV II）；若無“S”型擴增曲線，則樣品中不含有草魚出血病II型病毒（GCRV II）或含量低于檢測限。
NG反應管結果顯示“陰性”，PG反應管結果顯示“陽性”，此次檢測結果有效，否則無效。如重復檢測結果仍為無效，請與技術支持人員聯系。