熒光偏振法快速、準確、高通量檢測IgG和含Fc段衍生物
Dr. Carolanne Doherty
Valitacell, NIBRT, Fosters Avenue, Blackrock, Dublin, Ireland
BMG多功能酶標儀可應用于定量IgG的新技術Valita?TITER
采用熒光偏振法直接在細胞培養上清液中檢測IgG
酶標儀預設檢測程序和數據分析模板提高研究速度
簡介
準確、快速和高通量檢測IgG對于大多數治療性抗體的開發和生產來說是必不可少的。單克隆抗體正在生物藥物領域大顯身手，大量的樣本正等待著進行篩選以進一步得到開發。這里我們介紹一種在細胞培養上清中直接定量IgG的全新的篩選技術：Valita?TITER。
現有的技術，包括蛋白A高效液相色譜（HPLC protein A）、ELISA技術、 蛋白A表面干涉法以及HTRF（均相時間分辨熒光）都具有明顯的缺點，包括價格昂貴、耗力以及耗時。
Valita?TITER方法是一種全新的非常精確、低成本的檢測IgG的方案，檢測范圍在2.5-80mg/L。Valita?TITER采用熒光偏振技術檢測IgG的Fc段與蛋白G的結合（圖1）。分析在96孔板中進行，操作簡單、高通量、快速且可自動化完成。分析可以在很少量的細胞培養基中進行且沒有繁瑣的準備過程。
在這個應用指引中，我們介紹了在PHERAstar?，POLARstar? Omega以及CLARIOstar?多功能酶標儀上使用Valita?TITER試劑盒定量檢測IgG的方案。
圖1：熒光偏振法定量測定IgG的Valita?TITER分析原理示意圖。96孔Valita?TITER微孔板的每個孔中預先包被了標記了熒光的可與IgG結合的多肽-蛋白G（A）。IgG樣本結合于多肽上并通過熒光偏振和彌散（去偏振）進行測定（B）。
圖2：分析原理：分析利用熒光偏振法進行IgG定量。通過測定因分子旋轉而產生熒光偏振來測定樣本的濃度。小的、無結合分子在溶液中轉動快，而大的、結合的分子轉動慢。
熒光偏振可以有效地分析分子大小的改變。“不動”的熒光基團在偏振光的激發下會發出與激發光相同偏振方向的熒光。然而，轉動的熒光基團的熒光偏振方向與激發光偏振方向相比會有一定的改變。在溶液中小分子比大分子轉動更快，因此，連接有熒光基團的分子大小的改變，可以通過熒光去偏振程度的大小來進行測定。所以，當標記有熒光的蛋白G在沒有結合其它分子時，其轉動快，去偏振更多，而結合了IgG則相反（大5倍）（圖2）。這種偏振的改變應用于檢測溶液中的IgG。熒光偏振（FP）通過用平行偏振方向的激發光照射溶液并在平行方向和垂直方向上測定發射熒光。FP就是這兩個偏振熒光的歸一化后的差別，通常用mP表示。
材料和方法
Valita?TITER分析試劑盒
Valita?TITER APP軟件（試劑盒里提供）
IgG標準品（從人血清中獲得IgG）
PHERAstar, POLARstar Omega和CLARIOstar多功能酶標儀 (BMG LABTECH)
實驗過程
樣品的準備遵照試劑盒說明書的相應要求。標準曲線的繪制采用每個相對熒光值對應一個IgG標準品的方法。在Valta?TITER微孔板的每個孔中加入60μl重建緩沖液以及60μl標準品或樣品。混勻后避光孵育30分鐘。然后在POLARstar Omega、PHERAstar或CLARIOstar多功能酶標儀（BMG LABTECH公司）中，采用預置的檢測程序進行讀數（參數的設定詳見下表）。在MARS分析軟件中將獲得的Raw Data轉化成.csv格式文件，再用Valita?APP軟件進行分析。
儀器設定
結果與討論
圖3的標準曲線（2.5-80mg/L）是在BMG LABTECH公司具有熒光偏振檢測功能的多功能酶標儀（POLARstar Omega、CLARIOstar和PHERAstar）上用Valita?TITER試劑盒繪制的。所有酶標儀所獲得的結果都具備很高的穩定性。
圖3：在CLARIOstar多功能酶標儀上用Valita?TITER構建的IgG定量標準曲線。誤差線表示3個復孔的標準差
最后，我們用不同條件培養的樣品，用Valita?TITER定量IgG的結果與用常規方法HPLC的結果進行對比。圖4顯示兩種方法測定結果的相關性，顯示兩種定量方法都有很好的準確性，而Valita?TITER分析速度更快因其不需要繁瑣的樣本準備過程。
圖4：Valita?TITER定量IgG的結果與常規HPLC的結果進行對比
結論
在研發和生產此類生物藥物中對混合樣本進行快速IgG濃度測定非常重要。這里我們介紹了一種基于熒光偏振法的快速、簡單的進行高通量IgG和Fc段衍生物測定全新技術——Valita?TITER分析法。Valita?TITER分析法可以直接對待測樣本中的IgG進行定量測定而無需繁瑣的樣本準備或純化過程。CLARIOstar， PHERAstar和POLARstar Omega應用于Valita?TITER分析時現實出卓越的性能。與其它IgG的定量方便相比，Valita?TITER具有高通量、簡單、準確、快速的特點。
