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  • 發布時間:2020-04-15 21:52 原文鏈接: 熒光原位雜交(FISH)技術的應用與實驗流程

    分子診斷是診斷市場增長最快的部分。螢光原位雜交和FISH分析包括700萬人口的5億美元的市場。。FISH市場預計為11%,較去年同期成長為下一個五年。400至500萬人口的市場,在美國產生。FISH測試是用來識別生物標記DNA / RNA的形式。它是用于遺傳作圖和基因表達分析公知的方法。這種技術使用熒光染料標記的探針,并映射到一個染色體或幀內核DNA,以產生在原位通過顯微鏡觀察熒光信號的核苷酸序列。它是如細胞離心涂片(細胞懸浮液),然后觸摸用制劑或福爾馬林固定的新鮮制劑進行的,也可以使用石蠟包埋的(FFPE)組織中。它主要用于以下領域研究和臨床診斷:
    ?產前診斷
    ?癌癥診斷
    ?出生缺陷的分子細胞遺傳學和精神發育遲滯
    ?染色體異常
    ?臨床遺傳學
    ?神經科學
    ?生殖醫學
    ?毒理學
    ?微生物生態學
    ?進化生物學
    ?比較基因組學
    ?細胞基因組學
    ?區分良性和惡性腫瘤
    這個市場的多數是試劑包括FDA批準測試,伴隨診斷,研究僅使用探測器,定制試劑探針和支持和供應。有必要進行雜交執行這些勞動密集型的測試設備。理解需要雜交過程設備要求必須清晰地定義。
    必要的設備如下:
    ——酸度計
    ——天平
    ——攪拌盤
    ——微離心機
    ——冰箱
    ——冷凍
    組織準備要求:
    ——切片機
    ——水浴
    ——原位雜交箱
    執行FISH過程將需要下列設備和材料除了試劑:
    ——載玻片干燥機
    ——水浴
    ——原位雜交爐
    ——Coplin罐
    ——蓋玻片
    ——染色皿
    ——橡膠膠水(可選:取決于設備使用)
    ——熒光顯微鏡DAPI過濾器(藍色),FITC過濾器(綠色),德州紅色過濾器攝影的能力
    FISH的過程——簡化
    樣品準備——depariffinization、脫水、空氣干燥,預處理(95 C @ 30分鐘,Coplin Jar),蛋白酶治療(37°C 10 - 20分鐘,Coplin Jar),脫水,空氣干燥,馬克,適用FISH類探測器,
    用水泥覆蓋玻璃
    變性 - 5分鐘@ 75°C(45 - 50℃,中期擴展+額外的步驟,以變性探針)雜交 - 37℃,16小時 - 72小時
    貼標過程
    直接標記 - 標簽結合到探針和它是較不敏感的
    間接標記 - 檢測之前附加步驟,用抗體,結果放大單檢測探頭
    存儲 - 4 - 8°C長達兩個月的時間,在黑暗區域 - 感光
    關鍵的流程步驟
    在FISH的過程分為兩個步驟需要的設備用于加熱的幻燈片;所述變性步驟和雜交。這些步驟是最FFPE FISH程序相似。
    變性:變性的探針和雙鏈DNA
    平均時間:5分鐘
    標準溫度:75℃
    雜交:探針雜交到靶核酸
    時間范圍:16 - 72小時
    標準溫度:37℃
    已經孵育好的幻燈片必須儲存在4 - 8°C,直到他們在顯微鏡下進行拍攝。他們可以在這些溫度儲存數月之久。

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