熒光原位雜交（FISH）探針的制備

實驗概要

本實驗介紹了熒光原位雜交（FISH）探針的制備原理及技術。

實驗原理

染色體熒光原位雜交始于傳統的細胞遺傳學和DNA技術的結合，這種結合開創了一門新的學科——分子細胞遺傳學。其基礎是Southern   blot原理，以半抗原如生物素、地高辛間接標記或以熒光素直接標記的已知核酸分子為探針，探針和靶序列雙鏈DNA變性后雜交，互補的異源單鏈DNA分子在適宜的溫度和離子強度下退火形成穩定的異源雙鏈DNA，通過熒光標記的親和素或抗地高辛抗體將半抗原顯示出來，通過熒光顯微鏡觀察雜交信號。FISH具有快速靈敏、特異性好的特點，可同時分析分裂期和間期的多個細胞，并進行定量；可以檢測隱匿或微小的染色體畸變以及復雜核型；還可以使用多種熒光標記，顯示DNA片段及基因之間的相對位置與方向，空間定位精確。

實驗步驟

第一天
缺口平移標記探針
1. 試劑準備
   1） 0.1mmol/L dNTP
0.3mmol/L dATP、0.3mmol/L dCTP和0.3mmol/L dGTP等體積混合。
   2） 0.1mmol/L dTTP
1倍體積的0.3mmol/L dTTP和2倍體積的三蒸水混合。
2. 缺口平移體系和反應條件
0.1mmol/L dTTP 6.5μl
0.1mmol/L dNTP 10μl
10× Nick Translation buffer 5μl
1mmol/L DIG-11-dUTP /Biotin-16-dUTP 0.5μl
Nick Translation Enzyme 10μl
DNA (1μg) X μl
H₂O 18-X μl
in total 50μl
以上為標記1μg DNA的缺口平移體系，若標記更多量的DNA，則試劑量和反應體系相應等倍擴大。各成分混勻后短時離心。對于≤10kb的質粒，于15℃反應3.5小時；對于BAC/PAC，于15℃反應9小時。
3. 凝膠電泳判斷探針大小
將EP管置于冰上，取其中5μl 于70℃加熱5分鐘后行2 ％瓊脂糖凝膠電泳以觀察所標記探針的大小，單一序列探針合適大小為200～600bp；如片段大小偏大，則于15℃延長反應10～30分鐘，再重復進行凝膠電泳，直至得到合適大小的探針。
4. 終止反應
向反應體系中加入1μl 0.5M EDTA和（或）70℃加熱5分鐘，以滅活酶。探針于-20℃保存備用。

第二天
1. 探針的沉淀和變性
   1) 探針混合物的組成
      a. 對BAC/PAC探針
DNA探針 5ul
Human Cot-1 DNA 3ul
Salmon Sperm DNA 0.5ul
H₂O 1.5ul
in total 10ul
      b. 對著絲粒探針：
DNA探針 5ul
Salmon Sperm DNA 0.5ul
H₂O 4.5ul
in total 10ul
   2) DNA的沉淀
將探針混合物與1ul（V/10）3M醋酸鈉（PH5.2）和27.5ul（2.5V）無水乙醇（-20℃凍存）混合，-80℃沉淀30min（或-20℃沉淀過夜），以14000g在4℃離心30min，以沉淀DNA。
   3) 清洗沉淀
小心棄去上清，用70 ％乙醇洗滌一次，再次以14000g在4℃離心15min；小心棄去上清，在45～50℃的中溫水浴中風干DNA沉淀10～15min。
注：當大部分乙醇蒸發時，白色的DNA沉淀變為半透明狀；一定要徹底清除乙醇，否則會在加入Master Mix后產生微小的沉淀，導致高背景。
   4) 溶解探針
加入5μl 預熱至37℃的去離子甲酰胺（PH 7.0），短時離心后在37℃振搖30min以充分溶解DNA；再加入預熱至37℃的Master Mix 5μl，短時離心后在37℃振搖15～30min。
注：振搖時間盡可能延長；DNA沉淀亦可以TE緩沖液1.1μl溶解后加入Vysis探針緩沖液4.4μl稀釋，混勻后瞬時離心，37℃振搖15～30min。
   5) 探針的變性和預雜交
短時離心后于80℃水浴中變性探針10min，冰浴5分鐘；短時離心，于37℃水浴中預雜交30～60min；獨特序列探針（如cDNA）和重復序列探針（如α-衛星DNA）探針，無需預雜交。
2. 標本（染色體靶DNA）的處理和變性
   1) 滴片和老化
 取出儲存于-20℃的細胞懸液標本，以1100  rpm.離心10min沉淀細胞，換用適量體積的新鮮甲醇:冰乙醇（v/v）＝3:1固定液重懸細胞并調整細胞密度，滴片，劃出雜交區域，晾干；在預熱到  37℃的2×SSC中老化30min（也可實驗前夜室溫過夜老化再以2×SSC浸泡2分鐘）；依次于70 %、90 %和100  %的梯度乙醇中依次脫水，每缸2min，晾干（以下略作“梯度乙醇脫水后涼干”）。
   2) RNase A消化
每張玻片上加30μl 100μg/ml RNA酶（將10mg/ml的RNase A儲存液稀釋100倍），蓋上22×22mm蓋玻片，置于37℃濕盒中孵育1小時；室溫下2×SSC中振蕩洗滌，5min/次×3次；梯度乙醇脫水后涼干。
   3) 靶DNA的變性
將玻片放入預溫至72℃（每增加一張玻片，溫度要提高1℃）的70 %去離子甲酰胺/2×SSC中變性2分鐘后，立即置入預冷至-20℃保存的梯度乙醇脫水晾干。
   4) 蛋白酶消化
將50μl 100 mg/ml的胃蛋白酶（終濃度為0.01 ％）加入預溫至37℃的50ml蒸餾水（PH 2.0，以適量稀鹽酸酸化）中，混勻；將變性后的玻片放入其中處理10分鐘；室溫下1×PBS中振蕩洗滌，5min/次×2次；室溫下梯度乙醇脫水后涼干。
注：靶DNA的變性和消化應與探針變性同步進行，完成后盡快進行雜交。
3. 雜交
將變性后的DNA探針加于玻片雜交區域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，封片后置于濕盒中，37℃雜交過夜。

第三天
1. 雜交后洗滌和半抗原信號放大
   1) 雜交后洗片
 小心揭去封片膠和蓋玻片，將玻片置于預熱至46℃的50 ％甲酰胺/2×SSC中，5min×3缸；將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 %  Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸；每張玻片滴加30  μl阻斷液1，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育30min；再次將玻片移入室溫下4×SSC/0.1 %  Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
注：此后步驟應注意避光操作。
   2) 滴加一抗
將4 μl  Anti-DIG monoclonal antibody 和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl  抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育1小時；室溫下4×SSC/0.1 %  Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
   3) 滴加二抗
將4 μl Anti-mouse-Ig-DIG 和1 μl  Biotinylated goat anti-Avidin 稀釋于100 μl 抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl  于雜交區域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育40min；室溫下4×SSC/0.1 % Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
   4) 滴加三抗
 將4 μl Anti-DIG-Fluorescein和0.5 μl Texas-red-Avidin 稀釋于100 μl  抗體稀釋液1中，混勻；每張玻片滴加25 μl 于雜交區域，蓋上22mm×22mm蓋玻片，于37℃濕盒中孵育30min；室溫下4×SSC/0.1 %  Tween-20中振蕩洗滌5min×2缸。
注：以上步驟按雙色FISH描述，若為單色FISH則選擇相應抗體即可。
2. 核復染和抗熒光淬滅劑封片
 將1.25 μl 5 mg/ml的DAPI加入50 ml 2×SSC中（終濃度為125  ng/ml，避光保存于4℃），混勻；將玻片置于其中，避光復染2min；2×SSC中洗滌5min；梯度乙醇脫水晾干；每張玻片滴加10 μl  抗熒光淬滅劑封片，蓋上22mm×22mm蓋玻片，-20℃避光保存。
3. 熒光顯微鏡檢測FISH雜交信號
 以熒光顯微鏡觀察，在DAPI/FITC/Texas  Red濾光鏡激發下觀察中期/間期細胞的熒光雜交信號，計數細胞和采集圖像。每例分析100～200個間期細胞核細胞，重疊、破損、未去除細胞質和雜交信號微弱的細胞核不計入其中。對于雙色雙融合FISH，細胞內雜交信號相互靠近（<1/10核直徑的距離）者計為一個信號。
4. 儲存數據

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