熒光定量PCR儀技術及其在醫學中的應用（一）

1 概述
        熒光定量多聚酶鏈式反應是一種新的核酸定量技術。該技術將熒光能量傳遞技術（fluorescence resonance energy transfer，FRET）應用于常規多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR儀中，從而進行定量檢測。FRET即是通過受體發色團之間偶極一偶極相互作用，能量從供體發色團轉移至受體發色團，轉移效率與曲個發色團之間距離的6次冪倒數成比例。與普通定量PCR相比，熒光定量PCR儀具有可實時監測、準確性高、效率高等優點，本文綜述目前國內外幾種熒光定量PCR儀技術及應用。
2 熒光定量PCR 方法
2．1 TagMan
TagMan技術是利用Tag酶5 外切酶活性，即Tag酶具有天然的5 、一3 核酸外切酶活性，能夠裂解雙鏈DNA5 端核苷酸，釋放出單個或寡核苷酸，裂解的zui佳底物是被置換了的具有又樣結構的單鏈DNA，水解作用發生于結合了置換部位的磷酸二酯鍵處。基于Tag酶的這種活性，設汁合成一個能與PCR產物雜交的探針，該探針的5 端標記一個熒光分子．3 端標記另一個熒光分子。其中3 端熒光分子能夠吸收5 端熒光分子發出的熒光，因此，正常情況下該探針檢測不到3 端熒光分子的熒光信號，但當溶液中有PCR 產物（模板）時，該針與模板退火，即產生了適合于核酸外切酶活性的底物，從而激活Tag酶5 外切酶活性，將探針5 端連接的熒光分子從探
針上切割下來，破壞了兩熒光分子間的FRET，從而發出熒光，切割的熒光分子數與PCR產物的數量成正比。因此，根據PCR反應液的熒光強度即可計算出初始模板的量。其主要不足是：

2．2 Molecular beacon
分子信標技術（molecular beacon）也是在同一探針的兩末端分別標記熒光分子和淬滅分子，與Tag Man探針不同的是，該探針5 和3 末端自向形成8個堿基左右的發卡結構，此時熒光分子和淬滅分子鄰近，因此不會產生熒光。當溶液中有特異模板時，該探針與模板雜交，從而破壞了探針的發卡結構，于是溶液便產生了熒光。熒光的強度與溶液中模板的量成正比。因此可用于PCR定量分析。該方法的特點是采用非熒光染料作為淬滅分子，熒光本底低 其不足之處是：（1）雜交時探針不能完全與模板結合，穩定性差；（2）探針合成時標記較復雜
近來，基于Molecular beacon的原理，人們對其進行改進，使用了一種發卡式引物（sunrise primer）．此法能將所有擴增產物均標記上熒光分子，因此熒光信號響應快。但無法區分特異和非特異擴增是致命不足 為了克服不足，人們義對其進行改進，發明了一種稱為蝎狀引物（scorpion primer）的熒光定饋PCR技術。該技術在引物與Molecular beacon探針之間連接一個間隔臂，使PCR延伸反應時不能夠延伸至Molecular beacon分了 這樣，非特異擴增產物便無熒光信號，但當有物異擴增產物時， 即可與Molecular beacon進行分了內雜交， 產生熒光信號既解決了非特異問題，又保留了響應快的特點。但仍存在雜交時， 探針不能完全與模板匹配及合成復雜的問題.
2．3 Amplisensor
Amplisensor是一種復合探針技術，一個探針上連接一種熒光物，另一探針連接一種淬滅物。 探針長度不同，其中淬滅物標記探針5 端多出7個堿基（GCGTCCC）。PCR擴增前需將熒光物標記探針與一個半套式PCR引物連接，PCR儀引物的5 應有一段與長探針互補的序列． 以便連接酶將該引物與短探針連接。擴增時該探針一引物復合物作為半套式引物摻入模板，從而釋放淬滅探針部分，破壞了熒光能量傳遞，產生熒光。熒光的強度與擴增時加入的模板數成正比。該方法主要特點：（1）采用半套式PCR擴增，提高了靈敏度，但無法區分引物二聚體形成產生的非特異擴增信號，使定量準確度受到影響；（2）每次PCR擴增前，要行Amplisensor的標記，增加了操作步驟和檢測成本；（3）中間需加入半套式引物，增加了污染機會。
2．4 Lightcycler
Lightcycler是新近發展起來的一種定量PCR技術，該技術將熒光分子和淬滅分子分別標記在兩個不同的探針上，形成發光探針和淬滅探針，發光探針的5 端與淬滅探針的3 端分別連接熒光分子。兩探針設計為可與模板同一條鏈相鄰的序列雜交，雜交時兩探針的熒光分子和淬滅分子緊密相鄰，從而發生FRET使熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比，以此進行定量分析。該方法淬滅效率高，但由于兩個探針結合于模板上，因此影響擴增效率。此外，由于需合成兩個較長探針，合成成本較高。