熒光顯微鏡的原理及應用要點

　　熒光顯微鏡是利用特定波長的光照射被檢物體產生熒光進行鏡檢的顯微光學觀測技術，已有100多年歷史。近年來，由于免疫熒光在醫學研究、診斷領域里的廣泛應用，FISH、綠色熒光蛋白(GFP)技術分別在基因組學、蛋白質組學研究方面的推廣，顯微照相、數字CCD成像技術的輔助驅動，賦予這一傳統技術更新的應用價值和生命力。

　　基本原理

　　熒光：是一種非溫度輻射冷光，據發生性質可分為光化熒光(由特定光源光譜激發而產生的熒光)、放射熒光(放射性物質激發)、生物熒光(生物體發出)、化學熒光(如磷氧化時)等。

　　熒光現象：某物質在受到某種特定波長的高能量光(短波長)照射后獲取能量，幾乎即時(約在10～15s后)其分子內的電子躍遷到較高能級軌道使分子進入激發態，激發態的分子不通過內部轉換方式消耗能量回到基態，而是釋放出相應較低能量的光量子→人眼可見的熒光(較長波長)。

　　熒光現象有兩種：一次熒光現象，又稱“固有熒光”或“自發熒光”，是指經照射后，就能發出熒光的物質，此類物質的化學特征是發光分子具有共軛雙鍵，π電子活動性大。二次熒光現象，又稱“繼發熒光”，物質經照射后不能或只能部分發生微弱的熒光，這樣就需先用熒光色素(或稱熒光染料、熒光探針)標記處理，將熒 光色素標記結合插入到不發光的活性分子中去，再經照射才能發生熒光。熒光色素應具備的基本條件是能與不發光分子的某個區域有特異性的牢固結合，同時不會影響被結合分子的結構和特性，光量子效率應≥013。

　　熒光的產生包含了激發(Excitation)和發射(Emission)兩個過程，激發光譜短于發射光譜，故光色不同。而不同的熒光物質或熒光色素有其最敏感而有效的激發波長，因此選擇合適的激發/發射光譜以獲得最佳的熒光鏡像質量是實驗中要首先考慮的。

　　熒光顯微鏡是利用“光化熒光”成像，如果所選激發波長在肉眼所看不見的近紫外光區(320～400nm)，熒光的發射光譜也較普通光鏡光源的平均波長短，光學分辨率提高。

　　應用要點

　　1)預檢查和調節

　　(1)每次進行熒光觀測前，必須例行檢查熒光裝置的燈絲對中、光路對焦、孔徑光闌、視場光闌設置等狀況。

　　(2)所需要的熒光激發/發射濾光片組件是否已裝在轉換器中，物鏡配置是否得當，除去物鏡前透鏡的油漬和灰塵。

　　(3)如同時進行透射光相差觀察，要檢查聚光鏡對中心及相差環與物鏡相反的共軛情況。

　　(4)檢查樣品載體(載玻片、蓋玻片和其他器皿)有否掛有液體、灰塵，厚度是否在物鏡標定的工作距離范圍內。切片樣品不能太厚，約≤10μm為宜。

　　(5)因照明光源含有紫外線，在載物臺前上方放一塊棕色遮光板，以防紫外線損傷視網膜。

　　(6)電壓不穩會降低高壓汞燈的使用壽命，光源電源最好加配穩壓器。

　　(7)為延長汞燈壽命，在開啟后15min方可關閉；汞燈熒光電源一旦關閉，再次啟動至少需等待10min，以使水銀蒸汽冷卻復至原態，否則會影響燈的壽命。

　　2)熒光鏡像觀察

　　(1)在開啟熒光燈源后約5～10min激發光強度趨于穩定，裝載樣品進行觀察；為防止在調焦和尋找物像過程中過度激發光照會造成樣品熒光淬滅，最好先通過縮小熒光照明器的孔徑光闌或加ND濾光片將激發光調節到適度強度，有規律地移動樣品臺，待確定鏡像后，在調節到最佳熒光狀態用于拍攝記錄。

　　(2)鏡像質量不佳的調整。排除樣品制備因素外，可進行的必要調節措施是：

　　①排除成像光路中的遮光或限光器件，如DIC附件、ND濾光片等。

　　②重新調節熒光照明器的收光器對焦和孔徑光闌大小。

　　③細心調節物鏡覆蓋差校正環。

　　④復查熒光激發/發射組件是否與所標記的熒光色素對應。

　　(3)在不影響分辨率的前提下，于照相取景框和CCD靶面范圍之外，可盡量回縮熒光光路視場光闌和物鏡(100X物鏡)的數值孔徑光闌調節環，以避免雜散光的影響、提高景深，并可減小激發面積防止附加樣品淬滅。

　　(4)暫時不觀察時，應阻斷激發光路。

　　(5)油鏡觀察時，須用“無熒光油”，尤其是在U、V激發時，因常規鏡檢用的香柏油帶有青色熒光。

　　3)熒光照相和數字CCD相機圖像采集

　　(1)熒光照相

　　①盡管肉眼觀察熒光鏡像亮度與普通明場相差無幾，而實際上曝光時間要增加數倍甚至幾十倍，應使用快速感光膠片，如ISO200(24DIN)、ISO400(27DIN)。

　　②根據熒光物像在測光區的分布比例和鏡像的明暗程度設置曝光補償調節，原則上適當增補償，以獲得背景黑暗熒光圖像明亮、鮮艷的照片效果。

　　③如果沒有照明標線取景器，可先選擇較明亮的熒光區域進行對焦調整。

　　④對點狀熒光物像或撲捉某點為主的拍攝，可選擇適當的點測光模式。

　　⑤對在同一幅需要同樣條件拍攝的分散點狀熒光物像，可試用點測光配合自動鎖定方式拍攝。

　　⑥曝光過程應避免任何振動，有條件可配置防震臺。

　　(2)數字CCD相機圖像采集①光學接口的中間倍率要與CCD的芯片尺寸合理匹配。

　　②采用合適的熒光拍攝模式，摸索減背景(Background Subtraction)處理條件，根據鏡像情況設置Binning、Gain、Gamma等參數。

　　③因CCD芯片靈敏度較高，如果熒光鏡像過于明亮，為獲取對比度較好的采集圖像，可適當縮小熒光照明器孔徑光闌或加ND濾光片，特別是在熒光輝光較強影響拍攝樣品細節的情況時。

　　實際工作中，為獲得較好的熒光圖像拍攝質量需要對上述調節機制的綜合運用，反復摸索、優化條件。