五. 操作步驟
層析柱的準備
(1) 清洗：每組取一支層析柱，用清水沖洗干凈。
（若玻璃柱較臟，應卸去塑料裝置，先入洗液中浸泡2小時。）
(2) 安裝與檢查：檢查出口裝置中尼龍綢或燒結濾板是否完好干凈。安裝層析柱，讓其垂直固定于滴定臺架上。對準出口處，放一只250mL燒杯。向層析柱內灌洗脫劑，打開出口螺旋夾，檢查有無滲漏、出口乳膠管是否通暢等情況。
(3) 排氣泡：保持柱內一定的水位，用手指彈擊柱壁，部分氣泡會從溶液中上浮排出。出口處的小氣泡易停留在螺旋夾附近的乳膠管內，要想法排盡，否則會影響分離結果，排氣完畢，保留柱內1～2cm高水位，關緊螺旋夾。
(4) 標記高度：在距頂端8～10cm處做一標記，作為衡量灌裝層析介質床體高度（15～17cm）的依據。
2. 裝柱
每組用50mL燒杯取溶脹的凝膠懸漿25～30mL，靜置片刻，觀察凝膠沉淀與水的體積之比，約為1:1即可，否則應作調整。
輕輕攪勻杯中凝膠，用玻璃棒引流入柱，打開出水口，并不斷地向柱內補充凝膠，直到凝膠沉淀高度位于標記上方約2cm為止，凝膠柱內若有氣泡和斷層或柱床表面干水和歪斜，都將影響分離效果。必要時，需倒出凝膠，重新裝柱。
3. 平衡
取 15mL洗脫劑，用滴管沿柱內壁旋轉著緩緩流下，不可沖動膠平面，打開出水口，經洗脫液的流動，一方面清洗內壁，另一方面使膠床收緊。洗脫平衡完畢，膠床上方保留約4cm高水位，關閉出水口。此時，膠床高度≥15cm為宜。
4. 準備收集
取6只干凈的刻度試管（除凈試管內殘留的水），1～6編號，并在試管2mL處作一標記，插入試管架上，為收集洗脫樣品作好準備。
5. 上樣與收集
打開出口排水，當膠床與上方水層的彎月面相切時，關閉出口，用滴管將0.2mL混合樣液沿柱內壁緩緩加入，勿沖動膠面。上樣完畢，打開出水口，開始收集一號管。每管收集洗脫液 2mL。
當樣液進入膠床，其彎月面與膠平面相切時，暫停排液，用滴管將洗脫劑沿柱內壁旋轉著加入1cm高水位，然后排液，至其彎月面與膠平面相切，再緩緩注入3～5cm高的洗脫劑。
6. 洗脫
不斷向柱內加洗脫劑，保持膠床上水位3～5cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6號管達2mL時，關閉出口。
7. 鑒定
另取6只干凈試管，按收集順序將洗脫液一分為二，即每管1mL，依次在試管架上排成二排。
第一排每管加2滴BaCl2，根據白色沉淀多少，判斷SO42-在各管中的濃度。
第二排每管加1mL考馬斯亮藍G-250試劑，根據藍色情況，判斷蛋白質在各管中的濃度。將結果記錄于下表中。
若鑒定的第6號管中，仍有樣品，表明洗脫和收集不夠，需增加7號、8號……試管繼續洗脫與收集，同上法鑒定其蛋白質和鹽濃度情況。
8. 再生
鑒定完畢，打開出水口，繼續用２～３倍床體積洗脫劑洗脫，洗脫后關閉出口，以備下次使用。
六. 結果處理
根據實驗結果，在同一坐標系中，以收集的管號為橫坐標，顏色深淺程度為縱坐標，繪制二條（蛋白質及(NH4)2SO4）洗脫曲線。
2. 分析混合樣品分離效果。
附注
1. 凝膠的再生
通常層析柱經洗脫劑再生、平衡后，就可反復使用。但使用過多次后凝膠床體積變小，流速降低，凝膠污染雜質過多，甚至變色，需經再生后才可使用。再生方法有多種：如（1）用水進行逆向沖洗，再用洗脫劑平衡，便可重新使用。又如（2）把凝膠倒出，用6mol/L脲浸泡凝膠半小時，抽濾，再用水漂洗數次，除凈脲，必要時重復上述操作即可重新使用。
2. 凝膠的保存
(1) 濕法保存，可保存幾個月至一年，有多種方法：
加入防腐劑硫柳汞，使其濃度為0.005%，下次使用前，水洗除去硫柳汞。
加入幾滴氯仿，搖勻存放。下次使用前用熱水浴除去氯仿。（沸點60℃）。
凝膠保存在 60～70%乙醇溶液中，即凝膠以部分收縮狀態保存。
(2) 干法保存
此法操作不及濕法簡便，但處理得好，凝膠存放時間長。
先抽取過量水分，再向凝膠逐步加入百分濃度遞增的乙醇溶液，每次停留一段時間，使凝膠逐步脫水，最后加入95%乙醇，凝膠脫手收縮。抽干，鋪與搪瓷盆中，60～80℃經常翻動烘烤。若有結塊，在下次膨脹時會散開的，不可用力敲碎，否則會破壞顆粒結構。
3. 用鹽析法分離提取麥清蛋白
取10g小麥種子，粉碎。轉入250mL具塞磨口錐形瓶中。加100mL蒸餾水，在康氏震蕩器上震蕩1小時。靜置半小時，上清液以3000轉/分鐘離心15分鐘。將上清液在布氏漏斗上（鋪3～4層濾紙）抽濾。濾液應透明。用醋酸酸化濾液至pH4.7。加等體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪動，即有白色絮狀沉淀生成。置冰箱過夜，使麥清蛋白全部鹽析沉淀出來，以3000轉/分鐘離心20分鐘，棄去上清夜，加10mL無離子水使沉淀溶解，即得麥清蛋白和硫酸銨的混合液。