將樣品溶液用毛細管點在薄層板的一端，置密閉槽中，加入適宜溶劑為流動相。由于毛細管原理，溶劑被吸上，沿板移動，并帶動樣品中各組分向前移動，這個過程稱為展開。由于各組分性質不同，移動距離不同，展開一定距離后，即得互相分離的組分斑點。可用適當方法使各組分在板上顯示其位置，如組分本身有顏色，即可直接觀察，否則可噴顯色試劑或在紫外燈下觀察熒光等辦法確定
黃芩薄層層析圖譜
斑點位置。通常用比移值Rf表示組分移動的特性，其定義為：
Rf=組分移動的距離/溶劑前沿移動的距離
=原點至組分斑點中心的距離/原點至溶劑前沿的距離。
在薄層、溶劑、溫度等各項實驗條件恒定的情況下，各物質的Rf值是不變的，它不隨溶劑移動距離的改變而變化。Rf與分配系數K的關系：
Rf=1/(1+αK)，
α是由薄層性質決定的一個常數。由此可見，K值愈大，溶質分配于固定相的趨勢愈大，而Rf值愈小；反之，K值愈小，則分配于流動相的趨勢愈大，Rf值是定性分析的重要指標。在流動相、固定相和展開條件固定時，Rf值是組分的特性，可用以進行定性鑒別。實用時也常將樣品與已知純物質同時展開，比較二者移動情況，進行定性分析。