薄層色譜法的操作

除另有規定外，將1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩地移動涂布器進行涂布（厚度為0.2～0.3mm），取下涂好薄層的玻板，置水平臺上于室溫下晾干，后在110℃烘30分鐘，即置有干燥劑的干燥箱中備用。使用前檢查其均勻度（可通過透射光和反射光檢視）。
手工制板一般分不含粘合劑的軟板和含粘合劑的硬板倆種。
常用吸附劑的基本情況：顆粒的大小，太大洗脫劑流速快分離效果不好，太細溶液流速太慢。一般說來吸附性強的顆粒稍大，吸附性弱的顆粒稍小。氧化鋁一般在100-150目。氧化鋁分為堿性氧化鋁，適用于碳氫化合物、生物堿及堿性化合物的分離，一般適用于PH為9-10的環境。中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、酯等PH約為7.5的中性物質的分離。酸性氧化鋁適用于PH4~4.5的酸性有機酸類的分離。氧化鋁、硅膠根據活性分為五個級，一級活性最高，五級最低。
黏合劑及添加劑：為了使固定相（吸附劑）牢固地附著在載板上以增加薄層的機械強度，有利于操作，需要時在吸附劑中加入合適的黏合劑：有時為了特殊的分離或檢出需要，要在固定相中加入某些添加劑。
薄層板的活化：硅膠板于105-110℃烘30分鐘，氧化鋁板于150-160℃烘4小時，可得活性的薄層板。 除另有規定外，用點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0cm，樣點直徑及點間距離同紙色譜法，點間距離可視斑點擴散情況以不影響檢出為宜。點樣時必須注意勿損傷薄層表面。
點樣直徑不超過5mm，點樣距離一般為1~1.5cm即可。
樣品在溶劑中的溶解度很大，原點將呈空心環——環形色譜效應。因此配制樣品溶液時應選擇對組分溶解度相對較小的溶劑。
點樣方式有點狀點樣和帶狀點樣。
展開劑也稱溶劑系統，流動性或洗脫劑，是在平面色譜中用作流動相的液體。展開劑的主要任務是溶解被分離的物質，在吸附劑薄層上轉移被分離物質，使各組分的Rf值在0.2~0.8之間并對被分離物質要有適當的選擇性。作為展開劑的溶劑應滿足以下要求：適當的純度、適當的穩定性、低黏度 、線性分配等溫線、很低或很高的蒸氣壓以及盡可能低的毒性。
展開方式總的來講平面色譜的展開有線性、環形及向心3種幾何形式。
A 單次展開 用同一種展開劑一個方向展開一次，這種方式在平面色譜中應用最為廣泛。（垂直上行展開，垂直下行展開，一向水平展開，對向水平展開）
B 多次展開 單向對此展開，用相同的展開劑沿同一方向進行相同距離的重復展開，直至分離滿意，廣泛應用于薄層色譜法
C 雙向展開 用于成分較多、性質比較接近的難分離組分的分離。
薄層展開室需預先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，并在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂的蓋，使系統平衡或按正文規定操作。將點好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0cm（切勿將樣點浸入展開劑中），密封室蓋，待展開至規定距離（一般為10～15cm），取出薄層板，晾干，按各品種項下的規定檢測。
影響展開的因素
A 相對濕度的影響
B溶劑蒸汽的影響（a 展開室的飽和b預吸附）
C 溫度的影響
D 展距的影響與分離度僅正比與展距的平方根。 A 光學檢出法
a自然光（400~800nm）
b紫外光（254nm或365nm）
c熒光一些化合物吸收了較短波長的光，在瞬間發射出比照射光波長更長的光，而在紙或薄層上顯出不同顏色的熒光斑點（靈敏度高、專屬性高）
B 蒸汽顯色法
多數有機化合物吸附碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐色斑點，這種反應有可逆及不可逆兩種情況，前者在離開碘蒸氣后，黃褐色斑點逐漸消退，并且不會改變化合物的性質，且靈敏度也很高，故是定位時常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強了共軛體系，因此在紫外光下可以發出強烈而穩定的熒光，對定性及定量都非常有利，但是制備薄層時要注意被分離的化合物是否改變了原來的性質。
C 物理顯色法
用紫外照射分離后的紙或薄層后，使化合物產生光加成，光分解、光氧化還原及光異構等光化學反應，導致物質結構發生某些變化，如形成熒光發射功能團。發生熒光增強或淬滅及熒光物質的激發或發射波長發生移動等現象，從而提高了分析的靈敏度和選擇性。
D 試劑顯色法
廣泛應用的定位方法。用于紙色譜的顯色劑一般都適用于薄層色譜，還有防腐劑的顯色劑不適合用于紙色譜及含有有機黏合劑薄層的顯色，又時噴顯色劑后續加熱，這也不是用于紙色譜。
顯色方法a噴霧顯色：顯色劑溶液以氣溶膠的形式均勻的噴灑在紙和薄層。b 浸漬顯色：揮去展開劑的薄層板，垂直的插入盛有展開劑的浸漬槽中，設定浸板及抽出速度和規定在顯色劑中浸漬的時間。
顯色試劑
a 通用顯色劑硫酸溶液（硫酸：水 1：1，硫酸：乙醇1：1）、0.5%碘的氯仿溶液、中性0.05%高錳酸鉀溶液、堿性高錳酸鉀溶液（還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色斑點）
b 專屬顯色劑
⑸測定比移值
在一定的色譜條件下，特定化合物的Rf值是一個常數，因此有可能根據化合物的Rf值鑒定化合物。
⑹ 薄層掃描
薄層掃描法指用一定波長的光照射在經薄層層析后的層析板上，對具有吸收或能產生熒光的層析斑點進行掃描，用反射法或透射法測定吸收的強度，以檢測層析譜。對于中成藥復方制劑，亦可用相應的原藥材按需要組合作陰、陽對照，然后比較其薄層掃描圖譜加以鑒別。使用儀器為薄層掃描儀。
如需用薄層掃描儀對色譜斑點作掃描檢出，或直接在薄層上對色譜斑點作掃描定量，則可用薄層掃描法。薄層掃描的方法，除另有規定外，可根據各種薄層掃描儀的結構特點及使用說明，結合具體情況，選擇吸收法或熒光法，用雙波長或單波長掃描。由于影響薄層掃描結果的因素很多，故應在保證供試品的斑點在一定濃度范圍內呈線性的情況下，將供試品與對照品在同一塊薄層上展開后掃描，進行比較并計算定量，以減少誤差。各種供試品，只有得到分離度和重現性好的薄層色譜，才能獲得滿意的結果。