在用酒精沉淀出DNA(DNA抽提中的步驟一)后剩余的苯酚—乙醇上清中可以抽提出蛋白。沉淀的蛋白可通過蛋白[質]印跡法對樣品中某一特殊的蛋白質進行分析。
試劑所需,但沒有隨同提供的物品:
* 異丙醇
* 0.3M鹽酸胍(用95%酒精配制)
* 無水乙醇
* 1% SDS
1.蛋白質的沉淀
用異丙醇從苯酚—乙醇上清中沉淀蛋白(大約每1 ml TRIZOL試劑會剩下0.8 ml苯酚—乙醇上清液)。最初勻漿化時每1 ml
TRIZOL試劑加1.5 ml異丙醇。將樣品于15—30℃下放置10分鐘,然后在2—8℃下以12,000×g的離心力離心10分鐘。
2.蛋白質的洗滌
除去離心后的上清液并用0.3M鹽酸胍(用95%酒精配制)洗滌蛋白沉淀3次。按照最初勻漿化時每1mlTRIZOL加2
ml洗滌液。在每一洗滌周期中,蛋白質和洗滌也要在15—30℃下作用20分鐘然后在2—8℃下以7,500×g的離心力離心5分鐘。最后的一次洗滌完成后,加2
ml無水乙醇旋渦振蕩溶解蛋白沉淀,混合物在15—30℃下放置20分鐘后再在2—8℃下以7,500×g的離心力離心5分鐘。
3. 蛋白質沉淀的再溶解
真空干燥蛋白質沉淀5—10分鐘。移液管吸取1%
SDS溶解蛋白質。要完全干燥蛋白質沉淀可能要求將蛋白質樣品置于50℃洪箱中干燥。對于其中的任何不溶性的沉淀物可以在2—8℃下
10,000×g的離心力離心10分鐘去除,并將上清液轉移到一干凈的試管中。這時樣品已經可以用于Western
blotting或保存于-5—-20℃為將來備用。
蛋白抽提注意事項:
1.溶于0.3M鹽酸胍(用 95%酒精配制)或者溶于無水乙醇中的蛋白質沉淀可以在2—8℃下存放至少一月,在-5—-20℃下至少存放一年。
2.以下均為更有效回收蛋白可選的方案。在2 — 8℃下用0.1% SDS透析苯酚-酒精上清液3次。以10,000×g的離心力高速冷凍離心透析后的物質10分鐘,再用清潔的上清液做Western blotting。
3. 只要SDS的濃度足夠低(<0.1%)不至于干擾測定,蛋白質就可以用Bradford法進行定量分析。沒有洗滌劑干擾的方法,不依賴 A260/A280值測量蛋白質含量的方法均可使用(因為殘留的痕量苯酚可能使得蛋白質的濃度被高估)。
疑難解答:
蛋白質抽提
?產量低
1.樣品勻漿化或裂解不完全。
2.終DNA不完全再溶解。
?蛋白質降解
從動物身上取下的組織沒有立即處理或冰凍
? PAGE上的條帶變形
蛋白質沉淀洗滌不充分