蛋白激酶C異構體分析實驗

有 PKC 活性的酶樣品

[γ-32P] ATP 溶液PKC 反應緩沖液TCASDS - PAGE 樣品緩沖液

30℃ 水浴P81 磷酸纖維素膜離心管

1. 每個分析反應按以下比例將各反應組分加入 1.5 ml 微量離心管中：

4 μl 5 × PKC 反應緩沖液

1 μl 10 mg/ml 組蛋白 H1

1 [γ-³²P] ATP 溶液（ATP 終濃度為 5 mmol/L，放射活性為 5 μCi/μl）

0～14 μl 水

蓋好離心管，放入 30℃ 水浴溫育 10 min。

三個反應為一組設立無底物和酶的對照。每個反應的容積為 20 μl。在步驟 2 中加入水的量取決于所用酶樣品的多少。

2. 加入 1～14 μl 有 PKC 活性的酶樣品到預熱的反應混合液中，開始反應。

3. 30℃， 溫育 10 min。

4. 按不同的分析方法加入適當的試劑停止反應：加入 20 μl 10 % 預冷的 TCA 進行 TCA沉淀，10 μl 或 20 μl 預冷的 2 × SDS - PAGE 樣品緩沖液進行電泳分析。可用 10 μl 的反應產物點膜，使樣品吸附在 P81 磷酸纖維素膜上。用那些方法中的一種繼續進行分析。