56) 向您請教一個問題，我用pET28載體、宿主菌BL21(DE3)表達目的蛋白，目的蛋白的兩端都帶His-tag,蛋白的大小為37kD，在利用Ni-NTA純化時總是在目的蛋白帶旁邊伴隨一條帶去除不了，請問有什么高招可以解決這個問題？!!!此外，該表達產物為包涵體，請問這種產物可不可以直接用來制備抗體？謝謝！！！
也許這兩個都是你要的目標蛋白呢,會不會是這樣呢,你可以用his的抗體做WB看看是不是這樣的,如果是,那說明是這樣的情況.此外你可以再平衡緩沖液中加0.5%的吐溫等表面活性劑,這樣可以去除一些非特異吸附,此外你可以用pH45左右的變性溶液去洗,這樣也能去掉一些雜質,最后在用咪唑溶液洗脫.如果你這樣都去不掉,而做WB也有兩條帶,那說明可能是降解,超聲破碎的時候功率別太大,時間也別太長,注意溫度,因為超聲有時候也可能會使蛋白降解.
57) 我做得GST融合純化，目的蛋白在66KD附近，但每次純化出來的總有雜帶，特別是最近的一條帶，濃度較大，不論降溫還是改變誘導劑濃度始終去不掉，您有什么高見，謝謝。
你可以在你的平衡緩沖液里加一些鹽,0.2-0.5MNaCl,這樣可以降低一些因為離子作用帶來的非特異吸附.同時在平衡液里加0.5%吐溫等表面活性劑,這樣是不是有點改善,此外你也可以用階段洗脫的方法,例如用5mM和10mM還原谷胱甘肽去分別去洗脫,這樣看看有沒有什么區別.此外還要注意的問題是超聲破碎時注意功率和時間.避免過強時間過長,降解蛋白.
此外你可以GST抗體做WB看是不兩個都是你要的東西，會不會是降解或造成這樣的結果。你可以加點酶的抑制劑，此外抱歉我不是主任，嘿嘿。
58) 我準備用30％－60％硫酸銨沉淀透析、離心后去上phenyl－sephorase柱。但發現活性大部分還在沉淀中。測了一下蛋白濃度是20mg/ml。是不是濃度太高啊？
30％－60％硫酸銨沉淀可能對你的目的蛋白來講，太粗略了，如你所言，目的蛋白可能在沉淀中，可否分級沉淀，３０％－５０％，５０％－６０％，再測一下活性可能就分開了，20mg/ml的蛋白濃度對于層析是有點高，洗脫液濃度變化或PH的改變都會使蛋白有損失，最好不要超過１０mg/ml。
59) 我的蛋白是用pGEX-4T載體在BL21中表達的，表達量很高，形成包涵體，為了獲得可溶性蛋白，我現在嘗試用較低濃度的誘導劑誘導，此前用不同濃度誘導做過對比，電泳后表達量的差異不大；但當我再降低溫度誘導后發現，超聲處理后的上清液中目的蛋白條帶很微弱，大部分目的蛋白還是在沉淀中；這和我降低誘導劑前做的不一樣（同溫度），為什么目的蛋白的可溶表達會不穩定呢？對同一菌種應該是固定的吧？我很迷惑．
另外，請問，一般情況下２８度，３０度誘導時間應該分別多少才合適？我們的光度計出了點問題，無法測定ＯＤ值．謝謝．
還有，你有沒有較好的蛋白純化的文獻介紹幾篇，好嗎？
60) chromatography 兄，請教一個問題:
選擇填料的時候，CM和SP怎么選擇？什么時候選擇弱陽？什么時候選擇強陽？
再問一個：
我們實驗室有兩種蛋白，一種等電點5左右，另一種等電點9左右，為什么都可以用CM陽離子交換純化？（用的緩沖液都呈中性）
等電點5的那個我覺得選擇陰離子交換柱好些，為什么不這樣？
沒有什么特別的原則，重要是純化的效果好就可以，一般都是先選擇弱的．
純化是把目標蛋白和雜質分開就可以，所以其實在這樣的情況下，酸性蛋白是掛在陰離子柱上，而后面的掛不住，但是只要能把它們和雜質分開就可以．所以酸性蛋白流穿，雜質被吸附也可以，所以不一定非要吸附也可以．
61) 我準備用30％－60％硫酸銨沉淀透析、離心后去上phenyl－sephorase柱。但發現活性大部分還在沉淀中。測了一下蛋白濃度是20mg/ml。是不是濃度太高啊？
也不是，其實沉淀你可以做仔細點，例如先用３０％沉淀，取上清，再把上清加到４０％，然后如此類推，一直到６０％，然后測定沉淀和最后上清的活性，這樣就知道哪樣的濃度沉淀效果比較好，既然你的活性都在沉淀里，那直接溶解在一定濃度的鹽中，直接過濾上柱子就可以，濃度高也沒有關系．
62) 急問：我的樣品蛋白液本來放在４C保存，誰知有人把溫度調到了１８C已有一天，請問這樣對蛋白會有多大影響？我純化的是一種酶。另外，樹脂在這樣的溫度下性質會有所改變嗎？某人說４C－３０C的情況下，樹脂不會有太大改變。是這樣么？謝謝！
不知道你的蛋白穩定不穩定，你可以測定一下活性看看，如果沒有什么變化，那就沒有關系，樹脂不會因為溫度有什么變化的，尤其是你的樹脂不是以蛋白為配基的親和填料．，沒錯在４C－３０C的情況下是沒有多少改變，但是那也看多長時間，什么樹脂，因為時間長會長菌如果不加抑菌措施的話．
63) 我用鼎國的sepharose 4-B 合成親和柱可以嗎？
是活化好的嗎，還是普通的瓊脂糖，他們的填料顆粒有的比較粗，不知道你選擇的粒徑是多少范圍的，最好要細一些，４５－１６５um比較好，用一般應該沒有問題．
64) 比如說，sephadex G-25的分級范圍是1000～5000，我想問一下，分子量小于1000的分子（例如鹽）是怎么樣通過的？它是從凝膠內部通過嗎？不是說只有1000～5000大小的分子從凝膠內部通過嗎？
凝膠的中間有的是大小不同的孔,鹽自然在這些孔中間通過,而所謂的分離范圍也只是說在這樣的分子范圍內有差別,離開這個范圍就沒有分離效果,所以小的和大的都沒有什么分離效果,因此不是只有1000～5000大小的分子從凝膠內部通過.而是在這個范圍的分子有分離效果.
65) 請教：要從發酵液中純化出一個分子量約為1100的具有抗菌活性7肽，前期的提取采用的是酸沉醇提的方法，粗提物中蛋白含量39mg/ml。資料上說，純化這個小肽要用sephadexLH-20，可是我沒有。：（嘗試用sephadax G15 進行了純化，出現了五個沒有分開的峰，第六個峰分的還算可以。考慮到可能是粗提物中的組分太多，于是對粗提物用sephadex G200進行了純化，得到一個單一峰，收集后，冷凍干燥，再過sephadex G50，得到兩個吸收峰，可是實驗發現，這兩個吸收峰沒有抑菌活性了：（洗脫液用的是pH7.0的PBS，檢測波長280nm。請問可能出現的問題有哪些？洗脫液選擇的有問題？檢測波長有問題？｛我的這種多肽，資料上說HPLC的檢測波長為210nm,也有205nm的。｝
你的問題很不明確,用sephadexLH-20純化除了有一部分凝膠過濾外,還有一些分配色譜的作用,所以這個介質和sephadax G15 是不太一樣的,你純化出多少峰都應該進行抑菌實驗,否則很難知道你要的組分在哪里.既然這個分子量這么小,那你上sephadex G200,估計你的目標多肽在最后面,所以你得到的那個峰不一定有你要的東西,而在后面,我是這樣猜測的,關鍵你要測定活性,所以你再純化也沒有活性,問題在于你沒有時時做活性檢測,填料選擇不很正確,檢測波長我不清楚對不對,關鍵你要選擇合適的柱子,同時每一步都做活性檢測.