二、蛋白樣品制備
1. 單層貼壁細胞總蛋白的提取
（1） 倒掉培養液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養液（或將瓶直立放置一會兒使殘余培養液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
（2） 每瓶細胞加3 ml 4℃預冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1 min洗滌細胞，然后棄去洗液。重復以上操作兩次，共洗細胞三次以洗去培養液。將PBS棄凈后把培養瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結晶時才可與裂解液混合。）
（4） 每瓶細胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細胞充分裂解培養瓶要經常來回搖動。
（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側（動作要快），然后用槍將細胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進行。）
（6）于4℃下12000 rpm離心5 min。（提前開離心機預冷）
（7） 將離心后的上清分裝轉移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存。
2. 組織中總蛋白的提取
（1）將少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
（2） 加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進行勻漿。然后置于冰上。
（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復碾幾次使組織盡量碾碎。
（4） 裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。
3. 加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取
由于受藥物的影響，一些細胞脫落下來，所以除按1操作外還應收集培養液中的細胞。以下是培養液中細胞總蛋白的提取：
（1）將培養液倒至15 ml離心管中，于2500 rpm離心5 min。
（2）棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復洗滌一次。
（3）用槍洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經常彈一彈以使細胞充分裂解。
（4）將裂解液與培養瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。
三、 蛋白含量的測定
1. 制作標準曲線
（1）從－20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。
（2）取18個1.5 ml離心管，3個一組，分別標記為0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各種試劑。
（4） 混勻后，室溫放置2 min。在生物分光光度計（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2. 檢測樣品蛋白含量
（1）取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測蛋白。
（2） 取一管考馬斯亮藍加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標準曲線的程序下按blank測空白樣品。
（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用無菌水洗一次。
（4）取一管考馬斯亮藍加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。
注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次。可同時混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節省很多時間。測得的結果是5 ml樣品含的蛋白量。
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