蛋白質分析技術(AnalyticalTechniquesforProtein)3

六、SDS-PAGE
1.SDS及SDS-PAGE
（1）SDS：十二烷基硫酸鈉（sodium decyl sulfate，SDS），一種陰離子去污劑，它能以一定的比例和蛋白質結合，形成一種SDS—protein的復合物。
（2）SDS- PAGE：具有SDS的PAGE，分離SDS—protein復合物，通常把這種電泳稱為SDS-PAGE。
2.SDS的作用
protein （四級結構） →SDS-protein subunit
SDS-protein消除或掩蓋了不同種類蛋白質分子原來電荷的差異。
SDS- protein引起蛋白質構象的變化（變成長橢圓形，短軸長度都為1.8nm，長軸長度與蛋白質分子量成正比）。
因此蛋白質在SDS-PAGE 中的泳動率不受其原來電荷和分子形狀的影響，只決定于分子量。
M = k·10-bm, lgM = lgk－bm = c－bm
3. SDS-PAGE應用
測定未知蛋白質的分子量（亞基）
純度鑒定
生物分子配基是否脫落等。
SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, a common technique for separating proteins at good resolution. The protein mixture first is treated with SDS, a negatively charged detergent that binds to proteins. This binding dissociates multimeric proteins and forces all polypeptide chains into denatured conformations with nearly identical charge:mass ratios. During electrophoresis, the SDS-protein complexes migrate through the polyacrylamide gel. Small proteins are able to move through the pores more easily, and faster, than larger proteins. Thus the proteins separate into bands according to their size as they migrate through the gel. The separated protein bands are visualized by staining with a dye.

七、濃度梯度聚丙烯酰氨凝膠電泳

1.濃度梯度PAGE的結構與功能特點：聚丙烯酰胺濃度由上到下形成由低到高的連續梯度，梯度凝膠內部的孔徑由上而下逐漸變小，電泳后不同分子量的顆粒停留在與其大小相對應的位置上。
2. 濃度梯度PAGE的制作過程
3. 濃度梯度PAGE的應用：測定天然蛋白質的分子量；分離和鑒定生物大分子。

八、印跡轉移電泳（electrophoretic blottransfer）

1.印跡轉移電泳：通過凝膠電泳將分離的蛋白質再次經過電泳，轉移到固相載體表面的過程，稱為~。
2.轉移蛋白質的固相載體：濾紙、硝酸纖維薄膜、醋酸纖維薄膜等。常用的是硝酸纖維薄膜，其強度好、化學性質穩定。
3. 印跡轉移電泳裝置
4. Electrophoretic blottransfer的應用（1）檢測特定的蛋白質組分（2）尋找蛋白質的相應配（3）診斷疾病的工具。

Western blotting, or immunoblotting. (a) A protein mixture is electrophoresed through an SDS gel, and then transferred from the gel onto a membrane. (b) The membrane is flooded with a solution of antibody (Ab1) specific for the desired protein. Only the band containing this protein binds the antibody, forming a layer of antibody molecules (although their position can't be seen at this point). After sufficient time for binding, the membrane is washed to remove unbound Ab1. (c) In the development step, the membrane first is incubated with a second antibody (Ab2) that binds to the bound Ab1. This second antibody is covalently linked to alkaline phosphatase, which catalyzes a chromogenic reaction. Finally, the substrate is added and a deep purple precipitate forms, marking the band containing the desired protein.
九、聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）
聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦：
帶電的兩性電解質（如蛋白質）在pH梯度中進行電泳，根據被分離物質等電點不同而進行分離的方法，又稱電聚焦（electrofocusing）或聚焦電泳（focusing electrophoresis）。
2. 聚丙烯酰胺凝膠pH梯度的形成及其等電聚焦的原理
聚丙烯酰胺 + pK和pH各自相異而又相近的兩性電解質
通電形成pH梯度
蛋白質樣品（兩性電解質）移動到其等電點的pH區域，并在此pH環境下聚焦
3.IEF的優點：
擴散作用小；加樣區域不限；樣品的過分稀釋也對電泳不影響。
4.IEF的應用：
測蛋白質的等電點；蛋白質的微量分析；蛋白質的純度鑒定；鑒定蛋白質構象是否改變，是否有脫氨基等現象。

十、雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳
1.雙相電泳的操作過程
先作第一相電泳
將第一相電泳后的凝膠沿電泳方向縱切成薄的長條，然后埋于第二相電泳凝膠板中進行第二相電泳（兩相的電泳方向是互相垂直的）。
如果兩相電泳的pH值不同，必須將第一相電泳的凝膠條放在第二相電泳的緩沖液中預先浸泡。
2.應用：復雜的樣品分析、觀察蛋白質空間構象改變等電泳現象差異以及用作分析抗原抗體的雙相免疫電泳等。

Preparation of a two-dimensional protein gel by isoelectric focusing (IEF) followed by SDS electrophoresis. Two-dimensional gel of protein extracts from cells growing in a medium. Each spot represents a single polypeptide;
polypeptides can be detected by dyes, as here, or by other techniques such as autoradiography. Each polypeptide is characterized by its pI (isoelectric point) and molecular weight.
Autoradiography. A radiation-sensitive photographic emulsion containing silver salts (AgBr) is placed over tritium-labeled cells attached to a glass slide (for the light microscope) or to a carbon-coated grid (for the electron microscope). The cell regions containing the labeled molecules emit radioactive particles, along the tracks of which silver is deposited. When the photographic emulsion is developed, the silver deposits appear as dark grains under the light microscope and as curly filaments in the electron microscope.
十一、免疫電泳（immunoelectrophoresis）
1.定義：是把瓊脂電泳和免疫擴散結合起來用于分析抗原或抗體性質的一種檢測方法。
2.免疫電泳的種類
微量免疫電泳（micro immunoelectrophoresis）
火箭免疫電泳（rocket immunoelectrophoresis）
交叉電泳（crossed electrophoresis）
親和免疫電泳（affinity immunoelectrophoresis）

十二、染色方法
（一）蛋白質的染色
1. 氨基黑10B（amino black 10B或amidoschwarz 10B或naphthalene blue black 2B 200）
amino black 10B的分子式：C22H13N6S3Na3，MW=715，λmax=620~630nm，酸性燃料。
amino black 10B與protein結合的基團：磺酸基 + Pr→復合鹽
缺點：靈敏度不高；著色點不等、色調不一，誤差較大。
2.考馬斯亮藍R250（coomassie brilliant blue R250，CBB R250或PAGE blue83）
CBB R250分子式：C14H44O7H3S2Na，MW=824，λmax=560~590nm
結合蛋白質的原理：通過范德瓦爾鍵與蛋白質結合。
優點和缺點：靈敏度高（比氨基黑10B高5倍）；適用SDS-Pr染色，用于蛋白質微量分析。背景顏色深，定量不準確；對一些堿性蛋白質及低分子量蛋白質（如組蛋白）會從凝膠中洗脫。
3. 考馬斯亮藍G250
CBB G250分子式：CBB G250比CBB R250多二個甲基，MW=854，λmax=590~610nm
結合蛋白質的原理 同CBB R250
優點和缺點：同CBB R250，只是靈敏度不及CBB R250，但仍是amino black 10B的3倍；能選擇地使蛋白質染色而幾乎無本底色。
4.熒光染料
丹磺酰氯（dansylchloride，DNS-el）
原理：DNS-el + 蛋白質或氨基酸的NH2 →熒光性質→在320nm或280nm下 呈熒光區帶或斑點
優點：蛋白質或肽經丹磺酰化后并不影響遷移率，不阻止蛋白質水解。
熒光胺（fluorescamine，fluram）
原理：同DNS-el
優缺點：沒有熒光背景，易引起電泳遷移率改變（SDS可以消除此影響）。
2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮（MDPF）—同fluorescamine。
1-苯胺基-8-奈磺酸（ANS）：本身無色，但與蛋白質結合后，在紫外光照射下產生熒光。

5. 銀染色法
原理：染色機制尚不清楚，可能與攝影過程中Ag+的還原相似。
優點：靈敏度高，是CBB R250的100倍。
6.廣譜燃料（stains-all）染色法
染色配方及其染色程序
缺點：靈敏度低，SDS存在下不能染色。

（二）糖蛋白的染色
1.過碘酸-Schiff試劑
2.阿爾山藍（alcian blue）
（三）脂蛋白的染色
1.油紅（oil red）
2.蘇丹黑B（sudan black B）
3. 亞硫酸品紅：常用于醋酸薄膜脂蛋白電泳染色，生成紫紅
色脂蛋白染色帶。
（四）特異酶的檢測
1.酶作為蛋白質，通過電泳，定位在凝膠某一位置。
2.酶催化某些化學反應→產生顏色很深的不溶性產物→指示
酶在凝膠中的位置。