基 本 方 案 可 溶 性 或 膜 結 合 抗 原 的 分 離材 料抗 體（Ab)-Sepharose (單兀 12. 2) 活 化 的（對照）Sepharose填料，用于制 備 A b -Sepharose填 料（單 元 12. 2)，但去除了抗體或偶聯時用無關抗體替代 細胞或勻漿的組織 T S A 溶液，冰預冷 裂解緩沖液，冰預冷 5 % (m /V ) 脫 氧 膽 酸 鈉（Na-D O C ，過濾除菌并室溫保存） 洗滌緩沖液 VTris/Triton/NaCl 緩沖液， p H 8.0 和 p H 9.0，冰預冷 lmol/L Tris ? Cl， p H 6. 7 ，冰預冷 層析柱儲存液，用冰預冷 層析柱 超速離心機 quick-seal 離 心 管（Beckman) 注 ：包含抗原的所有步驟都必須在4°C 冷室或冰浴中進行。 1.制備一個A b -Sepharose親 和 層 析 柱（如 5m l ; 每 毫 升 Sepharose填 料 可 結 合 5m g 抗體）和 一 個 活 化 的（對照）Sepharose預 柱（如 5m l 的裝載柱體積偶聯或不偶聯無關的抗體），并將它們串聯起來（圖 12. 1.1)。為了流速最大化，最好使用比較粗的層
析柱，將 Sepharose填料填充至柱內，柱高不要超過柱直徑的2 倍 。裝 載 5 ml Sepharose填料時可采用10?20m l 的注射器。 2 . 將 50 g 細胞冰預冷T S A 溶液懸浮成濃度為I X l O 8?5 X 1087個細胞/m l 的懸液，或每一收集細胞或勻漿的組織體積加入1?5 倍體積的冰預冷的 T S A 溶 液 。并加入等體
積的冰預冷的裂解緩沖液，在 4°C 攪 拌 lh。 對于糖基磷脂酰肌醇（GPI) 錨定蛋白質，在 20°C賻 育 IOmin可利于蛋白質的有效溶解。 3.4°C ， 4000 g 離 心 IOmin去除核酸，倒出上清液并保存。 4 . 對于純化膜抗原，加 入 0.2倍 體 積 的 5 % Na-D O C 至去除核酸的上清液中， 4°C 或冰浴 IOmin后 ，轉移至quick-seal離心管， 4°C ， 100 OOOg離 心 lh，小心取出上清液保存備用。 5 . 將 Sepharose預柱與親和層析柱連接好（圖 12. 1.1)利用下列溶液清洗這兩個層析柱： 1 0 柱 體 積（column volume， C V ) 洗滌緩沖液 5CVTris/Triton/NaCl 緩沖液， p H 8.0 5C V T H S/Triton/NaCl 緩沖液， p H 9.0 5C V 三乙醇胺溶液 5C V 洗滌緩沖液。 6 . 將 步 驟 3 或 步 驟 4 的 上 清 液 上 樣 到 預 柱（保留部分樣品用于下述步驟1 2 的分析），并 以 5C V / h 的流速流經兩個層析柱。每 1/10?1/100上樣體積時，收集流穿組分。流速可通過靜水壓力調節，最大可達到250 cm/h (圖 12. 1,1)。通常上樣兩天對層析柱沒影響，但如果上樣持續時間較長，則表明層析柱阻塞或裂解液黏性太大，
后者通常是由于存在D N A 。 7 . 用 5C V 洗滌緩沖液清洗層析柱，然后關閉兩個層析柱的開關，將預柱與親和層析柱連接拆開。打開親和層析柱的開關，使得層析柱頂端的液體排出柱體，保留柱子清洗時的所有組分。 8 . 每次變換緩沖液時要按下述步驟清洗免疫親和層析柱（步 驟 9?11)。關閉層析柱的開關，打開層析柱底部的螺帽。將一注射器與緩沖液槽出口端的管道相連，抽吸出管道中的緩沖液，將管子置于另一緩沖液槽，用注射器抽吸，使得管道中充滿緩沖液 ，然后移去注射器。將管子彎曲折疊從而調控流速，并用緩沖液清洗層析柱的內壁 。打開層析柱開關，使得緩沖液流入層析柱。將底部螺帽松松地扣在層析柱上，使得緩沖液流經層析柱幾厘米后，旋緊螺帽，開始清洗或洗脫。
 9 . 用 5C V 的洗滌緩沖液清洗層析柱，先 是 Tris/Triton/N a C l 緩沖液， p H 8 . 0 , 然后是Tris/Trkon/N a C l 緩沖液， p H 9.0。檢測最后一次清洗的組分，從而確定非特異性結合或從一些單克隆抗體上解離的蛋白質的洗脫狀況。 10.用 5C V 三乙醇胺溶液洗脫抗原，收集洗脫組分，并 將 1 體積洗脫液放入0.2體積的lmol/L Tris ? C U p H 6. 7 溶液中。 理想的三乙醇胺溶液的p H 可 使 得 配 體 完 全 解 離（無活性損失），這可通過用SDS——P A G E 分 析 20ul洗脫后的層析柱填料（Ab-Sepharose) 和 50^1洗脫液得以確證。 11.用 5C V T S A 溶液清洗層析柱。為了避免層析柱干掉，用 T S A 溶 液 4°C 保存層析柱以備用。 12.利 用 S D S - P A G E (單元12. 3 ) 和 銀 染（單 元 12. 4 ) 分析每一 50M1洗脫組分是否含有抗原。通 過 A b -Sepharose利用免疫沉淀法分析(X 5?I m l 樣品和代表性的流穿及洗滌組分，然后再進行SDS-P A G E 和銀染從而確定層析柱是否飽和。 如果洗脫過程中，抗體從填料上脫落，利 用 protein A -Sepharose可去除洗脫液中 的 抗 體（Ey M a L , 1978)。即使是結合力較弱的小鼠I g G l 亞群在p H 8 的條件下也 能 去 除 掉（M . Dustin， pers. C o m m .) 當利用辛烷基P-D -葡糖苷或脫氧膽酸鈉作為去垢劑時，可測定A 28。值對各組分進行初步分析。 備 選 方 案 1 抗 原 低 pH 洗脫附 加 材 料磷酸鈉緩沖液， p H 6. 3 甘氨酸緩沖液 lmol/L Tris ? Cl, p H 9. 0 1 . 制備層析柱和裂解液，清 洗 層 析 柱 并 分 離 抗 原（見 基 本 方 案 步 驟 1? 9 , 用 Tris/Triton/N a C l 緩沖液、 p H 8. 0 徹底清洗層析柱）。進行酸洗脫之前需去除脫氧膽酸鈉，因為脫氧膽酸鈉在低p H 過 渡 到 中 性 p H時，會形成沉淀或膠體。 2 . 用 5C V 的磷酸鈉緩沖液、 p H 6. 3 清洗層析柱。 3 . 用 5C V 的 甘 氨 酸 緩 沖 液 洗 脫 抗 原 。將 洗 脫 組 分 收 集 到 含 0 . 2 倍 體 積 的 lmol/LTris ? C U p H 9.0溶液的試管中，收集后立即混勻每一組分。 4 . 分析各組分是否含有抗原（見基本方案，步 驟 12)。 備 選 方 案 2 用 辛 烷 基 P-D-葡糖苷洗脫抗原附 加 材 料（其他材料見基本方案)辛烷基β-D -葡糖苷 1 . 制備層析柱和裂解液，清 洗 層 析 柱 并 分 離 抗 原（見 基 本 方 案 步 驟 1? 9 , 用 Tris/Triton/N a C l 緩沖液， p H 8. 0 徹底清洗層析柱）。 2 . 用 5C V 含 1 % 辛烷基β-D-葡糖苷的T S A 溶液洗滌層析柱。 3.用 5C V 含 0 ?l%Triton X -IOO 替 代 1 % 辛 烷 基 β-D -葡糖苷的三乙醇胺溶液洗脫抗原。 4 . 收 集 I C V 的洗脫液至含有 0 ?2C V lmol/L Tris ? C U PH 6. 7 的試管中。 5 . 清洗層析柱并分析各組分（見基本方案，步 驟 11?12)。 展開 | 
