蛋白質的雙向電泳實驗方法

第一向（等電點聚焦，IEF）

1）凝膠條的準備

1．以帽凝膠端（2個校準環：4mm和10mm）朝下，將4根玻璃管插入兩個凝膠灌注裝置的每個托架中，這樣玻璃管恰好站在兩個分隔室之一的“充填船”上。從玻璃管頂端到玻璃管底端拉入PP線（小心，線不易移動），否則以后將不能用它們將膠溶液拉上來。

2．溶解分離膠溶液和過硫酸銨溶液。必須監控凝膠溶液的溫度，因為高溫下（大于25℃）聚合作用太快。

3．分離膠溶液除氣4分鐘，在桌子邊緣輕彈玻璃管壁，避免產生氣泡。

4．融化帽凝膠溶液，除氣，步驟同3。

5．用Gilson移液管加35μl APS到1365μl分離膠溶液中，溶液應小心搖晃，避免氧氣進入膠內。

6．將分離膠溶液加到兩個凝膠灌注裝置的每一個充填船里（每4個管700μl）。所有的玻璃管末端都必須浸沒于凝膠溶液中。

7．小心將PP線抽出，將凝膠溶液拉上至23mm的標記。

8．換充填船分隔室。

9．使用一個Gilson移液管，加10μl 0.8％ APS到390μl帽凝膠溶液中，輕輕振蕩使之混勻。

10．  在兩個凝膠灌注裝置的每個充填船中的空余分隔室內加入200μl帽凝膠溶液；凝膠溶液應到達17mm的標記。

11．  移去充填船，允許凝膠溶液到達13mm的標記。經過這一步，有空氣進入管子底端和4mm標記處。

12．  聚合30分鐘后，將PP線抽出，去除凝膠表面未聚合的溶液。在毛細血管口部滴加一大滴去離子水，這樣在凝膠的上邊形成一個潮濕的室，在凝膠和水滴之間形成一個氣泡。用此方法形成一個潮濕的室，隨后用Parafilm膜封上帽凝膠一側。凝膠在室溫過夜，可以使之進一步聚合。制備好的管子如果保存于室溫，可以在第二天使用，或最遲在制備好第五天使用。

2）加樣

1．將乙二胺加入陰極溶液，除氣5min，下槽裝陰極溶液。

2．融解Sephadex溶液，加入108mg尿素和10μl兩性電解混合液到100mg Sephadex膠中，在渦旋器上充分振蕩10～15分鐘。

3．從凝膠灌注裝置移走凝膠管，把它們插入聚焦槽的陽極部分，仍應看到13mm標記。帽凝膠一端朝上。

4．將陰極溶液加入管子的陰極一邊，不要有氣泡（事先已除去水）。

5．將聚焦槽的陽極部分安放到聚焦槽的底部，管子必須浸入陰極溶液。

6．除去水，并將加樣側干燥。使用一個伸長的巴斯德移液管或凝膠裝填移液管頭將水吸去，然后用濾紙條將凝膠表面干燥。

7．融解準備好的樣品和覆蓋溶液。

8．用凝膠裝填移液管頭，迅速在膠上覆蓋大約2mm厚的Sephadex。

9．用一個凝膠裝填移液管頭，裝入樣品（1～15μl），加到Sephadex表面。加樣時，尖端必須接觸Sephdex表層，樣品應小心加入，避免氣泡。

10．  使用凝膠裝填頭，輕輕在樣品上加入5μl覆蓋液并分層，不要使覆蓋液和樣品相混合。然后在毛細血管中加入陽性溶液，不要引入氣泡。

11．  所剩的陽極溶液加入上槽，用緩沖液覆蓋所有的管子。

3）IEF電泳

電泳應分段升高以按下表獲得Vh（電壓×小時）乘積為1841：

凝膠平衡

1．融解平衡溶液（在IEF結束前1小時）。使用之前，在20ml平衡溶液中加入0.2g DTT。

2．IEF結束后，移去管子中的陽性和陰性溶液。

3．用87％的甘油溶液覆蓋帽（cap）凝膠一側。

4．加5ml平衡溶液到Petri盤。

5．用PP線擠出凝膠：PP線從帽凝膠一側插入，管子加樣一側浸入去離子水，小心地向下擠出凝膠。與此同時可看到水中的覆蓋液的溶解。凝膠被拉出5min后，用水迅速清洗擠壓端。然后將管子保持在盛有平衡溶液的Petri-盤子上，整個凝膠被PP線拉到盤子里。每個盤子里可平衡兩塊膠。

6．室溫振蕩平衡凝膠10分鐘整。

7．IEF之后，如果凝膠并不立刻使用，應倒出平衡緩沖液，并在Petri盤中－70℃保存。－20℃保存導致分辨率降低；液氮保存將破壞凝膠。

第二向（SDS－PAGE）

1）SDS-PAGE膠的制備

1．加熱瓊脂糖溶液至70℃使之液化。

2．冷卻瓊脂糖溶液至40℃，保持液態。

3．噴灑70％乙醇清洗玻璃板和隔板，并用Kimwipes刷干凈。

4．融解凝膠溶液和APS。

5．將玻璃板夾入夾緊裝置，該夾緊裝置放在灌裝支架的前面狹槽中，這樣旋鈕對著支架，而“尖角”向上。充分旋轉旋鈕以使厚的有機玻璃正好對齊后部邊緣。這時大玻璃板可以放在有機玻璃板的前面，隔板沿著左邊和右邊的邊緣。插入小板，用拇指輕壓玻璃板和隔板以確使玻璃板位于底部。用鉗子夾緊做好的“三明治”，后部邊緣出現Newton環說明旋鈕已經非常緊了。不要將旋鈕旋得過于緊，否則玻璃板會被夾碎。將三明治從支架抽出，用拇指檢查玻璃板和隔板是否與底部齊平。

6．在小玻璃板底部起172.5px處做標記，做為加樣得輔助（凝膠長度為165px）。

7．將凝膠“三明治”裝置夾到灌裝支架上，旋鈕向內，“尖角”向上。在有機玻璃板上加壓以使凝膠三明治插入小突起下面。

8．將18ml凝膠溶液和1.2ml APS相混合，不要有氣泡。溶液必須混勻，不要引進氧氣。

9．含有凝膠溶液得容器放在加樣槽的后面玻璃板上，這樣凝膠溶液可以沿著加樣槽從玻璃板流下而沒有氣泡，分離膠被加到標記處。

10．  迅速用去離子水覆蓋凝膠溶液，以利于聚合并使表面平坦。在凝膠一端用一巴斯德移液管防止攪動凝膠溶液，并使水在凝膠表面均勻地分層。60分鐘后，凝膠可以用于SDS-PAGE電泳。

2）加樣

1．用濾紙條去除凝膠表面的去離子水。

2．將凝膠“三明治”放到電極裝置上（旋鈕沖外，尖角向上）：首先將凝膠“三明治”放到電極裝置的上面部分，向電極裝置擠壓它使下面一部分固定。

3．在平板凝膠表面加IEF凝膠：從平衡緩沖液中取出凝膠條，縱向放到厚有機玻璃板的邊緣，盡量使凝膠條與加樣槽的邊緣靠近。使用小刮勺，將凝膠條輕輕向下推，使之小心的滑入加樣槽。凝膠條必須位于SDS-PAGE的表面，沒有氣泡。

4．使用Pasteur移液管，將加樣槽加滿40℃的瓊脂糖溶液（沒有氣泡），2分鐘后，瓊脂糖溶液應凝固。

5．在電極裝置裝入凝膠“三明治”以后，將BioRad槽注入620ml電極溶液，加溶液的時候避免泡沫和氣泡的形成。內槽中電極緩沖液面應到達電極裝置中紅塑料點的位置。

3）SDS－PAGE電泳

1．在將槽封閉之前，需要確定有機玻璃表面是否干燥，以避免形成“漸進”電流，凝膠表面必須覆蓋電極緩沖液。

2．電壓必須如下表所示分段升高，電流和功率要調到電源的最大值。電流值如表所述并在每一部內逐漸減小。在給定的時間間隔初始和結束的數值如下表所示：