圖17. TFA濃度對峰形和選擇性的影響
洗脫液：加入如圖所示的TFA，以20%~32%的乙腈（ACN）梯度洗脫，洗脫時間為15分鐘。
樣品1.血管緊張素II 2.血管緊張素III3.血管緊張素I
其它離子對試劑。盡管目前為止TFA仍是最常用的離子對試劑，但蛋白質/多肽分離有時會采用磷酸和七氟丁酸（HFBA）等其它試劑。
如圖18所示，一些情況下，磷酸可分離一些TFA無法分離的多肽。通常磷酸鹽使用濃度約為20-30 mM，pH為2~2.5。此外，磷酸鹽緩沖液對一些蛋白質的分離效果要優于TFA。
盡管同TFA一樣，磷酸鹽緩沖液使用的pH通常較低，但磷酸鹽緩沖液也能適應較高的pH，為選擇性和分辨率的改變提供了機會（見17頁）。
將磷酸鹽作為離子對試劑的主要弊端是：磷酸鹽不揮發，很難從肽中去除。
一些時候，七氟丁酸用作組蛋白等堿性蛋白分離的離子對試劑
圖18. 使用除TFA以外的離子對試劑可能會產生不同的選擇性
條件
色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米
洗脫液：
A.4%~40% 乙腈—0.1%TFA體系，pH=2,18分鐘梯度洗脫。
B.4%~40% 乙腈—20mM 磷酸體系，pH=2,18分鐘梯度洗脫。
樣品:
緩激肽
神經降壓素
蛙皮素
章魚唾腺精
pH值對多肽保留行為的影響。不論采用TFA和磷酸，還是其它離子對試劑，用于多肽分離的反相流動相通常適應的pH值較低。
在低pH值條件下，羧酸基團——端羧基，以及天冬氨酸和谷氨酸的側鏈會進行質子化，且僅有輕微極性。
將流動相的pH值增加至6~7將會使羧酸基團離子化，減弱多肽的疏水性。這將降低各種多肽的保留值，但尤其影響含天冬氨酸或谷氨酸的多肽（圖19）。
與其它多肽相比，含天冬氨酸和谷氨酸的多肽的保留值降低更多，從而改變了選擇性。盡管增加多肽分離流動相pH的做法不經常采用，但它可以在一些特定情況下發揮作用。
圖19. 流動相的pH值會影響多肽的保留值，尤其是含酸性氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）的多肽。
條件
色譜柱：ACE 5 C18-300，4.6 x 250 mm
洗脫液：
A.20%~32% 乙腈—0.1%TFA體系，pH=2,15分鐘梯度洗脫。
B.20%~32% 乙腈—10mM NH4OAc體系，pH=7,15分鐘梯度洗脫。
樣品
血管緊張素II
血管緊張素III
血管緊張素I
流速。流動相的流速對反相高效液相色譜法分離的分辨率影響不大。
如圖20所示，流動相流速為0.5、1.0或2.0 ml/min時，胰蛋白酶圖譜中多肽的分辨率大致相同。
但梯度體積必須恒定才能維持分辨率一致。
這需要隨著流速的增加減少梯度洗脫時間。
體系壓力隨著流速的增加而增加；體系壓力可能會限制可用的流速。
此外，較高的流速還會使檢測靈敏度稍有降低，但可能增加大分子蛋白或疏水性蛋白的溶解度。
圖20. 流動相的流速對多肽的分辨率影響不大。隨著流速的變化，總梯度體積必須保持恒定才能維持分辨率一致。
條件
色譜柱：C18小孔柱，4.6 x 250 mm
洗脫液：10%~50% 乙腈~0.1% TFA 體系，時間、流速如圖所示
樣品β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解物