蛋白質定量分析(Proteindetermination)

實驗概要

本文介紹了蛋白質定量分析(Protein determination) Bradford 的dye-binding method的原理、樣品配制及操作步驟等。

實驗原理

Bradford  的dye-binding method 是利用Coomassie brilliant blue G-250 (CBG)  可與蛋白質結合而變色的特性來定量 (Bradford, 1976)；若試樣中的蛋白質量較多，則結合到蛋白質而變色的CBG  也多，因而呈色較深。下例是以一組標準蛋白質為對象，制作一條蛋白質量與吸光度的標準校正線。

主要試劑

1. Buffer A-0

2. BSA標準品 (Bio-Rad, bovine serum albumin, 100 μg/mL)

3. 未知濃度樣本 (unknown BSA, 0.8 mL, 由教師調配發給)

4. Dye Reagent (Bio-Rad 500-0006) 先以水稀釋四倍備用。以染料Coomassie brilliant blue G-250 配制的溶液，勿與膠體電泳染色用的CBR-250 混淆，各有其使用上的特色，不要互用。

主要設備

1. ELISA光度計 (Dynatech)

2. 微量滴定盤 (microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404)

3. 大頭針或噴火槍

實驗材料

標準品及樣本：

標準品系列：使用小試管準備一組BSA (b) 標準品的系列稀釋：

配制一定要精準，否則校正直線不會很準確；各種試劑的添加，若自稀往濃取樣，則可以不用換吸管頭。

未知樣本：再以上述unknown BSA (c) 準備兩種未知樣本：Label 未知樣本 (c) Buffer A-0 Final Conc.

一般樣本：1)  通常由色析法所收集到的各分劃樣本，都可以直接進行蛋白質定量分析；但若其中含有某些干擾因子  (如含有Triton)，或樣本的濃度太濃，都必須將樣本稀釋后再測。2)  同一樣本的若干不同稀釋濃度，所測出來的最終蛋白質濃度會有差異，通常是以稀釋度大者較為準確。

實驗步驟

1. 每槽先加好50 μL標準品 (#0, #1 … #5) 或未知樣本 (X1, X2)，以二重復加入96 孔滴定盤中，如圖所示。

微量滴定盤的使用

2. 每槽再加入200 μL Dye-Reagent (d)，在全部樣本槽加完前，不要中斷添加；同時小心避免氣泡產生。

3. 輕拍滴定盤一側，使添加的各成份均勻混合，注意Dye-Reagent 密度較大，很容易沉積在下方而分層。若還有小氣泡，小心以大頭針刺破，大量時可用噴火槍火焰燒破。

4. 靜置室溫10 min.

5. 以ELISA reader測量570 nm (或595 nm) 的吸光值。

附    件   (共3個附件,占118KB)

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