蛋白質定量實驗

試劑、試劑盒 考馬斯亮藍 G250乙醇磷酸

實驗步驟

(1) 準備 100~1500 ug/ml 的標準品, 溶于 Bradford 法相兼容緩沖液中。對于較稀的樣品，可能通過增加樣品在試劑體積中的比率而擴大靈敏度（microBradfordassay:1~25ug/mL)。如果樣品與染料的比值太高, 可能會增加反應混合物的 PH 而導致反應背景較高。

(2) 將標準品和待測樣品加人到一次性的比色皿中 (應該使用一次性的塑料比色皿或微孔板，因為染料會黏附到各種材料容器的表面上）。

(3)Bradford 試劑預熱至室溫。將 ImL 染料溶液加人到 25 uL 蛋白質樣品中，混勻，室溫孵育 10 min。

(4) 檢測 450rnn 和 595nm 處的吸光度 (可以使用 570~610nm 的基于濾光器的儀器，對檢測性能不會有明顯的降低）。

(5) 對 595 nm 處的數據作圖，或為提高在低反應值處的精度，對 595 nm/450 nm 的比率作圖。標準反應曲線可以擬合為一個多項式反應，由此可以估算出待測樣品的濃度值.

注意事項

Bradford 法的優點有操作方便、靈敏度高和試劑的成本低等。對基于微孔板的檢測，試劑的總體積可以減少到 300 由于大多數微孔板分光光度計光源的路徑是垂直的，建議使用商業來源的 Bradford 試劑，以減少在長期儲存過程中發生的沉淀。

我們觀察到各種市售的 Bradford 制劑的反應存在著顯著的差別（Nobleetal.，2007)。在分析低分子質量的蛋白質或多肽時這種差異更加顯著。事實上，據報道，這種方法在應用中存在一個檢測分子質量的下限，也就是「閾值」，需要一定數量的特定殘基以形成可檢測到的信號 (deMorenoetal.，1986)。有報道稱，Bradford 試劑成分的改變會引起特定蛋白質反應的改變。因此，當比較不同供應商或不同制劑的 Bradford 數據時應該特別注意（Chanetal.，1995;FriedenauerandBerlet，1989;Lopezetal.，1993;ReadandNorthcote，1981)。

Bradford 法對各種試劑的干擾是敏感的，詳見表 8.1, 其中包括大多離子去污劑和非離子去污劑，以及糖基化的蛋白質。如果反應混合物發生沉淀，如檢測疏水蛋白或膜蛋白時，反應體系中可以添加 5%?10%(V/V) 的 Imol/LNaOH 來助溶。