蛋白質的定量測定實驗

Bradford 試劑牛血清白蛋白 (BSA) 標準溶液Tris-緩沖鹽溶液

微量滴定板分光光度計或酶聯儀

材料與設備

牛血清白蛋白 (BSA) 標準溶液 (2 mg/ml 水溶液）

Bradford 試劑（CoomassiePlus,PierceChemicalCo.)

分光光度計 (可在 595nm 處測量的) 或酶聯儀 (帶 595-nm 濾光片的)

微量滴定板（Immulon^TM2，Dynatech Laboratories,Inc.)

試劑

Tris-緩沖鹽溶液（TBS)

(配方，見"試劑的配制" PP.184~189)

操作程序

1) 用 TBS 配制成一系列稀釋度的 BSA 標準溶液，BSA 含量分別為：2000、1000、500、250、125、62.5 和 31.25ug/ml。每個待測的未知樣品亦用 TBS 配制成一組倍比稀釋的樣品液。

2) 各取 5ul BSA 稀釋液和未知樣品稀釋液，分別加入 1 ml Bradford 試劑。混合后，室溫孵育 5 min, 并在 1 h 內測 A_595nm 值。如有酶聯儀可用，測 A_595nm 值則更為方便。用微量滴定板法時，各樣品取 7ul 加入 200ul Bradford 試劑中，用加樣器吸頭混合，并保證微孔中無氣泡存在。若有氣泡，則可用一 22 號針頭將氣泡刺破。室溫下孵育 5 min 后，測定 A_595nm 值。

3) 可測兩種對照。—是測定存在于樣品中的各種緩沖液，看看它們本身是否會顯色。二是在有不同緩沖液存在的條件下測定中間濃度范圍的 BSA 標準，看看這些緩沖液是否干擾 BSA 的顯色。

4) 作標準曲線，確定未知樣品的蛋白濃度。
注：由于σ³² 純化過程中所甩的-些試劑（如:SKL、脫氧膽酸鈉和聚乙烯亞胺對本法有一定干擾，為此，我們找到了一種可以仿效的微量方法，即用 0、5、10、15 和 25ug/ml BSA 及 100、200 和 400 倍稀釋的制備物樣品進行測定。在微量滴定板各孔中，先加 100ul Bradfod 試劑，再分別加入各稀釋樣品 100ul, 然后按上述步驟搡作。