(1) 配制 10%(V/V)[5%(m/V)] 的 PEI 儲存液。PEI(WV) 常以 50%(m/V) 的黏稠液體狀態存在（來自于 MPBiochemicals 的 PEI, 其相對分子質量 Mw=50000?
100000, 也可采用其他來源，如 Sigma 和 Aldrich，Mw=750000)。取 10 mLPEI, 用雙蒸水 H2O 稀釋至 70 mL，并以濃鹽酸 (3.8?4.0 mL) 調節 pH 至 7.9。最后以雙蒸水 H2O 定容至終體積為 1 〇〇 niL。儲存液在冷室或室溫下是穩定的。應該注意的是, 有些公司提供的 PEI 溶液已經用雙蒸水 H2O 進行 I:1 稀釋, 以降低溶液的黏稠度, 有利于溶液的配制。其濃度僅為 25%(m/\〇。
(2) 在 30 mL 含有 50 mmol/LTris-Ha(pH7.9)、5% 甘油、0.1 mmol/LEDTA、0.Immol/LDTT 和 0.15mol/LNaCl 的緩沖液中通過超聲破碎?.cW 細胞 (約 3 g 的細胞沉淀物）。再以 15000r/min 離心 15 min 去除細胞碎片。所有的操作均在冰浴中進行。
(3) 將 PEI 沉淀實驗應用于具體的體系 (如下所述)。例如, 加人 pH7.910%(V/V)PEI，使其終濃度為 0?3%(V/V)，混合 5 min, 直到形成稠密的白色沉淀物。
(4)5000r/min 離心 5 min。注意: 不要離心太實, 否則沉淀不易重懸。將〇.3% 的 PEI 上清液棄去，保存用于下面的分析。干燥沉淀物 1?2 min，盡量去掉殘留的上清液。
(5) 用上述含有〇.4mol/LNaCl 的緩沖液 30 mL, 充分重懸 0?3%PEI 沉淀物。如果條件允許，可以采用 TissueTearor 勻漿器（BioSpecProducts,Inc.Cat#985370-07)，它可以很好地重懸沉淀物，有效地以物理形式洗掉陷入沉淀內的蛋白質，并洗脫與沉淀物 PEI 結合較弱的微酸性蛋白質。靜置 5 min，接著以 5000r/min 離心 5 min，并傾出 0.4mol/LNaCl 的緩沖液。
(6) 用上述含有〇?9mol/LNaCl 的緩沖液 30 mL, 充分重懸 0?4mol/LNaCl 沉淀物。這種洗脫液中含有更多的酸性蛋白質 (如 RNA 聚合酶），但同時會使核酸留存于沉淀物中 (可采用 I.6md/LNaCl 洗去核酸)。靜置約 5 min，混勻后以 15000r/min 離心 10 min。
(7)0.9mol/LNaCl 的洗脫液，需加入固體 AS 使其飽和度達到 60%(每 10 mL 加人 3.61 g)。持續混合至少 30 min 形成沉淀。以 15000r/min 離心 10 min。使沉淀物去水 5 min。該沉淀物中含有 AS 沉淀的蛋白質，而幾乎所有的 PEI 都會留存于上清液中。但還是會有微量的 PEI 陷入到沉淀物中，通常不會影響下面的操作。如有必要更徹底地去除這些微量的 PEI，可以采用含有 60% 飽和度 AS 的緩沖液重懸該沉淀物，并再次離心。
這種操作程序一般可以使 RNA 聚合酶從其他蛋白質中得到 6 倍純化，回收率大于 90%，在 1?2 h 內可去除幾乎所有的核酸。
⑴需著重強調的是, 從 0.9mol/LNaCl 洗脫液中去除 PEI 是必要的。如果僅采用稀釋或透析的方法達到低鹽濃度，蛋白質還是會與 PEI 結合, 并再次發生沉淀。
⑵我們發現，即使存在 1% 的 TritonX-100，PEI 沉淀還是會發生。
(3) 與 AS 沉淀不同，當用緩沖液 10 倍稀釋提取物時，需要加人同樣量的 PEI(如對于正常的提取物，用〇.3% 的 PEI 可以很好地沉淀目標蛋白質，而對于 1 〇倍稀釋的提取物，僅需要加入〇.03% 的 PEI，便可以達到相同的沉淀效果，當然，所用的體積為提取物的 10 倍)。這表明 PEI 可以緊密地結合酸性組分，本質上即為對其進行滴定。
既然我們不能預測需要多少量的 PEI 才能沉淀某一酸性蛋白質，或者需要采用多大濃度的鹽將蛋白質從 PEI 上洗脫下來，那么，建議還是先進行簡單的 PEI 沉淀和洗脫實驗 (BurgessandJendrisak,1975;BurgessandKnuth，1996)。基本上，該實驗的步驟如下所述。將 6 個 200 樣品分別裝于 6 個微量離心管, 再加入 10%(VAZ) 的 PEI, 使其終濃度分別達到〇%、〇.l%、〇.2%、0.3%、0.4% 和 0?5%(V/V)。高速混合微量離心管 Imin。進行上清液的酶活性或 SDS 凝膠電泳分析, 如有需要, 還可采用 WesternBlot 檢測沉淀所有目標蛋白質所需最小量的 PEI。我們假設其為 0.3%。接著，如上所述準備 6 個微量離心管，且每個離心管中均含有少量的 0.3%PEI 沉淀物，再加人 200JL1L 含有 0mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L 和 I.0mol/LNaCl 的緩沖液。
充分重懸。靜置 15 min，離心，如上所述分析上清液中的目標蛋白質。將不能洗脫任何蛋白質的最高鹽濃度溶液作為清洗液，將可以洗脫所有目標蛋白質的鹽濃度溶液作為洗脫液。
3.5 實例：采用 PEI 沉淀與 DNA 結合的堿性蛋白質最近，有研究者 (DuellmanandBurgess，2008) 設法純化由 coZi 表達的強堿性蛋白質，愛潑斯坦-巴爾病毒核抗原 (Epstein-Barrvirusnuclearantigen1，EBNA1)。我們在 0.1mol/LNaCl 的條件下，進行了 PEI 沉淀實驗，以研究是否可以沉淀核酸和酸性蛋白質, 并將堿性的 EBNAl 留存于上清液中（采用策略 B)。意外的是，當加入少許 PEI(0.15%)，EBNA1 可以沉淀，但是當加人更多的 PEKO.4%) 卻不能沉淀 EBNA1。這表明 EBNAl 與 DNA 已經結合，繼而與 DNA—起被沉淀。但是，在更髙濃度的 PEI 存在時，PEI 會優先與 DNA 結合, 并置換出 EBNAl。我們發現，可以采用 0.15% 的 PEI 進行沉淀，0.3mol/LNaCl 進行清洗,0_8mol/LNaCl 進行洗脫。這樣能夠在使 EBNAl 得到很好富集的同時，還可以快速地去除核酸。
本章已經著重討論過 AS 沉淀和 PEI 沉淀。下述內容將會簡單地論述用于蛋白質沉淀的其他方法，大量文獻已詳細描述了這些方法 [見 Englard 和 Seifter(1990);Ingham(1990)；Scopes(1994)]。
采用有機溶劑，如乙醇和丙酮進行沉淀處理，該方法已經有超過 100年的使用歷史，但是最為大眾所熟知的是 Cohen 和 Edsall 的經典研究成果，他們將其用于人血清蛋白質的分離。該沉淀方法的操作必須在較低的溫度下進行，以避免蛋白質變性。
蛋白質在其等電點會變得不可溶，此時，它帶有的凈電荷為〇，且蛋白質分子之間的電荷排斥力相對最小，因而相互之間能夠很容易地靠近。蛋白質在很低的離子強度下不易溶解，那么同樣也可以在很低的鹽濃度或無鹽時進行等電點沉淀操作。
本方法中，將細胞提取物加熱到一定的溫度，此時許多蛋白質會發生變性而沉淀，但目標蛋白質因其更穩定仍會保持可溶性狀態。該方法尤其可用于純化表達的嗜熱菌酶類，具體的操作可將細胞提取物加熱到足夠高的溫度，使幾乎所有的?：? 〇^蛋白質變性沉淀，而將熱穩定的酶留存于溶液中。
本方法可參見 Ingham(1990) 的綜述。
(1) 在清洗或洗脫階段，充分重懸蛋白質沉淀是十分重要的。雖然沉淀看起來十分結實, 但仍有大量的上清液陷人其中，且會附著于離心管的管壁。如之前所提到的一樣，盡量干燥沉淀物以除去其中存在的上清液。如果沉淀比上清液量大，建議采用 10 倍體積的適宜緩沖液進行重懸，以去除陷人到沉淀物中的上清液蛋白質。例如，用 40% 飽和度的 AS 進行沉淀時，可采用 40% 飽和度 AS 重懸沉淀然后再次離心。清洗 PEI 沉淀是一個非常有用的步驟, 推薦采用與 TissueTearor 類似的勻漿器，可以將沉淀打碎并形成均勻的懸浮液。如果重懸不充分, 那么清洗步驟將不能起到有效的去除核酸的效果，且分離作用也會相應降低。
(2) 混合時應避免泡沫形成。若有空氣混入蛋白質溶液中會促進蛋白質的氧化，同時在空氣-水界面可引起蛋白質的變性。