在過去的
2 0
年中，蛋白質組學技術的日益廣泛應用，使蛋白質濃縮和脫鹽的層析技術得到不斷革新。蛋白質組學通常需要從少量復雜的混合物中富集蛋白質，包括選擇性地濃縮特定種類的蛋白質。由于質譜
(M S )
和基于抗體檢測技術的高靈敏度及可提供詳細生化特征的性質，它們在臨床診斷、生物藥物鑒定以及蛋白質結構與功能的基礎性研究等廣泛的應用中具有很高的實用性。這些應用需要分析生物體液中含量很低的藥物靶標
和生物標志物,
或采集表達于異源系統的蛋白質的結構及翻譯后修飾的詳細信息。用于蛋白質組學分析的樣品通常來自于水溶液,
其中可能包含一系列不揮發的鹽類、溶劑、染料 、去污劑、離液劑、D N A / R N A
和脂類。這些污染物會降低高靈敏度分析技術的性能，尤其是對于電噴霧電離 (E S I) 基質輔助激光解吸/電離 (M A L D I ) 質譜
，它們通過干擾樣品電離、形成加合物以及形成離子源污垢等對分辨率和靈敏度造成有害的影響。因 此
，很多供應商已經開發出眾多用于目標蛋白質濃縮，并將它們從污染分子中進行高產率純化的微型固相萃取程序和設備。
凝膠過濾基質已經被廣泛應用于在非變性情況下蛋白質的脫鹽。與小分子物質不同，大分子蛋白質不會進入這些樹脂的小孔中，從而在流動過程中將鹽分除去。通常情況下
，填料體積是樣品體積的 4?2 0 倍, 同時柱長與柱徑的比值在 5?1 0 時, 層析柱的分辨率最佳。在脫鹽的過程中樣品最少被稀釋 1. 2
5 倍 ，但是，如果選擇合適的洗脫劑，即使樣品濃度在 ug/m L 的范圍內，其損失也可以說是微乎其微。由不同商家提供的基于多聚糖
的葡聚糖凝膠介質已經被廣泛應用于脫鹽，成
系 列 的 Bio-Gel P 丙烯酰胺基質 (Bio-R a d ，Hercules, CA)
，允許用戶根據目標蛋白質的分子質量定制介質的凝膠排阻極限。 ZebaSpin column (Thermo/Pierce， Rockford,
IL) 提供了更多的方便，它能夠通過離心作用對分子質量大于 7000 D a 的蛋白質樣品進行快速脫鹽而不需要柱平衡和重力流分級分離
。通過選擇適當的柱子尺寸，可以對體積為 2?4000ul的濃度低至25ug/m L 的蛋白質樣品提供較高的回收率，同時對分子質量小于 1000 D
a 的 分 子 具 有 高 達 95% 的 保 留 度 。 Zeba Spin m a t r i x 也可 以 以 9 6
孔板的形式使用，以方便同時對多個蛋白質樣品進行高通量的非變性脫鹽。
凝膠過濾蛋白質脫鹽的一種替代方法是使用混合床離子交換
(IE X ) 樹 脂 。大尺寸顆粒和表面修飾的混合床 IE X 吸著劑可以有效地捕捉小分子陰離子和陽離子(＜1000
Da),最小限度的截留高分子質量的蛋白質分子。脫鹽可以通過分批處理模式來實現，或通過一個基質填料床來實現。然而 ，這種技術一個不良的后果是:
在常規 IEX 吸附劑的混合床發生的離子交換可引起蛋白質樣品的酸化和沉淀。相比之下，用于牛奶和乳清脫鹽的
離子滯留基質，通過吸收而不是離子交換來進行鹽的攝取，因此，它可以在不發生顯著p
H 變化的情況下完成蛋白質的脫鹽。可在市場上買到如 A G ll A 8 樹脂 (Bio-R a d , H e r -cules， CA) 。
類似于凝膠過濾，這些技術的缺點是在脫鹽過程中發生蛋白質樣品的稀釋，因此可能在后續處理時需要對蛋白質進行濃縮。
反相 (R P ) 層析是分離、脫鹽和濃縮蛋白質的一項很流行的技術, 一定程度上是由于樣品被濃縮在小體積的可通過蒸發而去除的揮發性溶劑中。伴隨著常規分析方法—質譜 (M S) 的到來，各種各樣的反相提取形式被商業化，以提高質譜技術操作過程的速度和便利度。這些形式包括微型離心柱、毛細管、微量加樣器吸頭和微孔板，用于對樣品量低至飛摩爾(femtomole) 級的蛋白質進行快速脫鹽，并洗脫在微升級體積之中。通常情況下 ，在 p H < 4 和有離子配對劑（如 〇.1 % ?I.0 % T F A )存在的情況下可使蛋白質和純化柱中的膠實現最佳結合。有機組分的存在可能會促進蛋白質與純化柱中的膠可逆結合，一般 為 15 % 的乙腈或甲醇，或離液劑（如鹽酸胍)等。如果含有去污劑類污染物，則可能需要對樣品稀釋以防止其干擾蛋白質與吸附劑的結合。脫鹽操作需要對樹脂進行清洗, 如使 用 5 % 的甲醇、1% 的 T F A 等; 通過用可替代的離子配對劑進行實驗可能會達到有選擇的洗脫。要根據蛋白質的大小對反相吸附劑進行選擇, 通常使用脂肪族的 C 4 、C 8、C 1 2 和C 18化合物。基于微量移液器的產品的一個例子是ZipTips (Millipore， Billerica, M A )，它用反相樹脂顆粒或N u T i p s (G l y g e n , C o l u m b i a, M D )填充, 吸頭的內壁用結合材料包被 ，因此減輕了反壓力, 將樣品與吸頭表面的非特異相互作用減少到最小。為了同時對多個樣品進行高通量脫鹽, 也可以將反相樹脂置于 9 6 孔板中，其中一個例子就是 ZipPlate模式 (Millipore， Billerica， M A )。
除了常用的凝膠過濾、離子交換和反相吸附劑，可用的其他材料,
如分批的或置于微型設備中的樹脂可以支持多種模式的層析, 用于蛋白質的濃縮和脫鹽。這些包括疏水、親水
、金屬螯合、蛋白質親和樹脂。值得注意的是，當蛋白質樣品懸浮于一種有機溶劑并且需要去除污染的鹽分或去污劑的時候，親水介質為反相層析提供了一個有用的替代品。例
如 ，PAGE-P r e p 介質（T h e r m o /Pierce， Roc k f o r d, I L)，當蛋白質在5 0 %
二甲基亞諷存在的情況下與樹脂結合時，它 可 用 于 SDS-PAGE 分析前蛋白質的脫鹽。另 外 ，Glygen(Columbia， MD)
提供了微量移液器滴頭形式的親水介質 (N u T i p
)。類似于反相介質，親水性樹脂的潛在缺點是蛋白質常常以變性的形式收回。相比之下，更重要的是固定化金
屬親和層析(I M A C )吸附劑的使用，以及最近包含有TiO2的介質，已被有選擇的用于M
S分析前對磷肽類的濃縮和脫鹽。這一技術在信號轉導研究領域具有特殊的應用，因為檢測低豐度的磷肽類對了解細胞的反應是至關重要的。最 近 的 一 份
報 道（Hsieh et al.，2007)描述了 T i O 2納米顆粒基質的制備，它能夠在可防止非特異性結合的含0.丨 ％ T F A和 5
0 % 乙腈( p H 2. 0) 的溶液中選擇性的結合磷肽類。在這種情況下，洗 脫 由 P H 8. 5 的100 m m o l /L
磷酸銨來完成，它與磷酸化肽類的 M A L D I -M S 等檢測相兼容，不需要進一步的脫鹽過程。
使用高效液相色譜(H
P L C )技術為質譜(M S )分析準備蛋白質樣品的常規操作,
推動了供應商們去提供它們的吸著劑，成系列的柱子、套筒和毛細管等不斷出現并持續增加。這反過來又允許通過使用柱切換程序使樣品制備流線化。這種方法先用一個短的預裝柱進行蛋白質樣品的快速濃縮和脫鹽，接著可以通過使用一個長柱，在
同 樣 的 H P L C 系統對蛋白質進行高分辨率的分離。例如 ,P e p M a p 微量預裝柱(Dionex，Sunnyvale,
CA ) 可用于蛋白質樣品的快速濃縮和脫鹽，其填充床的長度僅為5 m m 。由于樹脂使用的可選擇性
，分析物的捕集效率由選擇的填料所支配，而樣品體積的減少改善了隨后層析步驟的分辨率。在此背景下，同樣值得評論的是，整體分離材料正被越來越多地用于對蛋白質的濃縮和脫鹽
(Schley et al., 20〇 6)。高 達
20um的有效孔徑允許溶質快速傳遞透過整體基質。相比較于在基于顆粒吸附劑的亞微米級孔隙內實現的由較慢的擴散作用所介導的液相傳質，整體介質可以實現在高流速低反壓力條件下的高效分離，特別有益于通過柱切換進行快速脫鹽。然而
，在一個更直接的方法里，Mass-Prep c o l u m n (Waters ， Milford，M A
)已被用于對疏水性基質中蛋白質的在線脫鹽, 樣品可直接注人E S I 質譜儀中( W h e a t
etal.， 2007)。此外，M A
L D I -M S 分析的樣品制備可以在不需要微量提取裝置的情況下執行。所以 ，在將蛋白質分別加載到M A L D I
板之前，眾多吸附劑已被用于對樣品進行分批脫鹽。最近發展的一個例子是Z n O 多 聚（甲基丙烯酸甲酯）納米顆粒吸附劑，在進行M A L D I
-M S 之前可以從蛋白質樣品中消除飽和水平的N a C l (6.2 m o l /L )、N H 4 H C O 3(2.
6 m o l /L ) 或 I m o l /L 的 尿 素（S h e n et al. ，
2008)。相似的，脫鹽作用通過使用一個疏水基質直接加入M A L D I 板的板孔中而實現(Jia et d . ，
2007)。在這種情況下，目標蛋白質被基質捕獲, 接著通過使用一個最小限量的板上清洗實現樣品的干燥、脫 鹽 ，此時樣品已可以進行M A L D I
-M S 分析而不需要進一步的純化。