蛋白質的電轉

實驗概要

很多膜可作為蛋白質電轉移的固相支持物，如重氮化纖維素膜（DPT，DBM)、DEAE-纖維素膜、尼龍膜等，但用的最多的還是硝酸纖維素膜(NC膜)，該膜與蛋白質以非共價的疏水作用形式結合，結合能力約為80μg/cm²。與其它膜相比，NC膜具有不要預先活化，對轉移物質生物活性影響不大，能應用多種染料染色，非特異性顯色淺的特點，但對于轉移的小分子蛋白質在洗滌過程中，易于丟失。

主要試劑

轉移緩沖液

含20%甲醇的電極緩沖液

主要設備

電轉移槽及電泳儀

實驗步驟

1. 剪6塊3MM濾紙和一塊NC膜

2. 將剪好的3MM濾紙和NC膜在轉移緩沖液中浸泡3-5分鐘

3. 按下列過程安裝轉移裝置，將塑料支架平放在含轉移緩沖液的托盤中，在塑料支架上放一塊海綿.

4. 將3塊3MM濾紙對齊放在海綿上，然后依次將NC膜、凝膠、及另３塊慮紙和海綿放上。

5. 用塑料支架夾緊上述各層，放入電轉移槽內，NC膜一側向正極，凝膠一面向負極。

6. 接通電源電壓120mA，轉移6小時以上或過夜。

7. 轉移結束后，取出塑料支架，依次取掉各層，用鉛筆在膜的上沿作好標記，切下其中一個孔所對應膜的一半，用氨基黑或考馬士亮蘭染色，檢查轉移效果。

8. 將其余的NC膜放在一張干凈的３MM濾紙上，室溫干燥30-60分鐘（可不做）。

注意事項

1. 慮紙及膜的大小不應大于待轉移膠的大小，否則在轉移過程中會發生短路，影響轉移效果。

2. 操作中應戴手套，切不可用手直接觸摸，因手上的汗和分泌物將直接影響到蛋白從膠向膜的轉移。

3. 放置NC膜和濾紙時，每層之間不應有氣泡，否則將影響轉移效果。

4. 待轉移蛋白分子量決定轉移時間，分子量大，轉移時間長，反之則小。

5. 干燥雖然可使蛋白質更牢固地結合到膜上，但也可能加劇蛋白的質變性，影響其免疫反應活性。