實驗方法原理
用大量中性鹽使蛋白質從溶液中析出的過程稱為蛋白質的鹽析作用。蛋白質是親水膠體, 在高濃度的中性鹽影響下脫去水化層, 同時, 蛋白質分子所帶的電荷被中和, 結果蛋白質的膠體穩定性遭到破壞而沉淀析出。經透析或用水稀釋時又可溶解, 故蛋白質的鹽析作用是可逆過程。鹽析不同的蛋白質所需中性鹽濃度與蛋白質種類及pH 有關。分子量大的蛋白質(如球蛋白) 比分子量小的( 如白蛋白) 易于析出。改變鹽濃度, 使不同分子量的蛋白質分別析出。
含鹽蛋白質溶液流經凝膠層析柱時, 小分子量的鹽分子因進入凝膠顆粒的微孔中, 所以向下移動的速度較慢; 而大分子的蛋白質不能進入凝膠顆粒的微孔, 以較快的速度流過凝膠柱, 從而使蛋白質與鹽分開。
蛋白質分子中具有芳香族氨基酸殘基, 因此, 對280 nm 的紫外光有最大吸收, 且成正比, 符合Beer 定律。將分步收集的樣品液于紫外分光光度計檢測, 收集蛋白質樣品。
實驗材料 蛋清血清
試劑、試劑盒 飽和硫酸銨溶液硫酸銨葡聚糖凝膠SephadexG-25
儀器、耗材 試管三角漏斗玻棒濾紙試管架752 型紫外分光光度計石英比色皿玻璃層析柱乳膠管止水夾
實驗步驟
1. 卵清蛋白的分離
(1)取卵清約2 ml 于試管中, 加等體積的飽和硫酸銨溶液,攪拌均勻, 蛋白質析出, 靜置, 用濾紙過濾致濾液澄清, 沉淀即為卵球蛋白, 將此沉淀用2 ml 半飽和硫酸銨洗滌一次。
(2)將析出卵清球蛋白后的濾液放入試管中, 再加入固體硫酸銨使之達飽和, 觀察有無沉淀產生, 若有沉淀, 則過濾之。濾出的沉淀即為卵清白蛋白。
2. 脫鹽
(1)凝膠柱的準備: 稱取葡聚糖凝膠sephadexG-25 5 g , 加入80 ml 洗脫液(蒸餾水) , 在沸水浴中溶漲30 min , 用傾瀉法傾去懸浮的小顆粒。然后裝進內徑1 . 2 cm, 高30 cm 的玻璃層析柱內。注意裝填均勻, 無氣泡和裂紋存在, 并保持液面在凝膠床表面以上。
(2)加樣與洗脫: 打開柱的出口, 讓柱內液體慢慢流出, 直至液面與凝膠床表面相平。然后加入2 ml 含鹽蛋白質溶液, 至樣品液面剛好到達凝膠床表面時, 漸漸加入30 ml 洗脫液, 以0 . 5～1 ml/ min 的流速洗脫, 每5 ml 裝試管分步收集。
(3)收集液的蛋白質含量可用280 nm 處的紫外光吸收法等檢測。鹽類可用離子呈色等方法鑒定。
(4)畫出蛋白質280 nm 吸收曲線圖, 將蛋白質溶液收集待用。
注意事項
1. 上述操作中加入固體硫酸銨的量可參看附錄計算后加入。
2. 裝柱加入凝膠時凝膠高度要達25 cm 高度左右, 否則由于容量小脫鹽情況不好。
3. 測量后的樣品不要倒掉, 收集蛋白質含量高的樣品封口后于冰箱保存。
4. 使用過一次的凝膠柱, 進行平衡后可再次使用。但使用過多次的應進行再生處理( 低濃度堿浸泡30 min , 用水洗至中性, 低濃度酸浸泡30 min , 用水洗至中性, 裝柱使用, 或加防腐劑于冰箱保存。