蛋白質紫外分光測定實驗

標準蛋白溶液 待測蛋白溶液

一、試劑

1．標準蛋白溶液

準確稱取經微量凱氏定氮法校正過的標準蛋白質，配制成濃度為1mg/ml的溶液。

2．待測蛋白溶液

配制成濃度約為1mg/ml的溶液

二、操作

1．標準曲線的繪制

按下表分別向沒支試管加入各種試劑，搖勻。選用光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長處分別測定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線。


2．樣品測定

取待測蛋白質溶液1ml，加入蒸餾水3ml，搖勻，按上述方法在280nm波長處測定光吸收值，并從標準曲線上查出經稀釋的待測蛋白質的濃度。

三、其他方法

1. 將待測蛋白質溶液適當稀釋，在波長260nm和280nm處分別測出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白質濃度。

計算

蛋白質濃度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260

式中A280和A260分別是該溶液在280nm和260nm波長下測得的光吸收值。

此外，也可先計算出A280/A260的比值后，從下表查出校正因子F值，同時可查出樣品中混雜的核酸的百分含量，將F值代入，再由下述經驗公式直接計算出該溶液的蛋白質濃度。

蛋白質濃度（mg/ml）=F×1/d×A280×N

式中A280為該溶液在280nm下測得得光吸收度值，d為石英比色杯得厚度（cm），N為溶液得稀釋倍數。

紫外吸收法測定蛋白質含量得校正因子


2. 對于稀蛋白質溶液，還可用215nm和255nm的吸收差來測定濃度。從吸收差△Ａ與蛋白質含量的標準曲線即可求出濃度。

吸收差△Ａ＝Ａ215－Ａ225

式中的A215和A225分別式蛋白質溶液在215nm和225nm波長測得的光吸收值。

此法在蛋白質含量達20-100μg/ml的范圍內，是服從Beer定律的。氯化鈉、硫酸銨以及1×10-1mol/l磷酸、硼酸和三羥甲基氨基甲烷等緩沖液都無顯著干擾作用。但是1×10-1mol/l乙酸、琥珀酸、鄰苯二甲酸以及巴比妥等緩沖液在215nm波長下的吸收較大，不能應用，必須降至5×10-3mol/l才無顯著影響。由于蛋白質的紫外吸收峰常因pH的改變而有變化，故應用紫外吸收法時要注意溶液的pH，最好與標準曲線測定的pH一致。

3. 如果已知某一蛋白質在280nm波長處的吸收值[A1%1cm]，則取該蛋白質溶液于280nm處測定光吸收值后，便可直接求出蛋白質的濃度。