蛋白質純化策略與考慮因素

　　純化策略及影響因素

　　今天分享一些有關蛋白純化過程中應該考慮的一些因素。

　　1、在進行一個蛋白純化之前，應該對其蛋白有所研究，包括其性質，敏感性，例如該蛋白的溶解性，對高鹽或pH敏感，是否容易氧化等；

　　2、需要考慮蛋白質的用途，來決定制備蛋白的量級規模，這就要考慮到層析柱的尺寸，得到的蛋白濃度如何，是否需要保持其活性以及避免不必要的污染物；

　　3、蛋白質的檢測方法，對于含有不同組分的蛋白溶液，其檢測方法通常不同，結合其靈敏度，精密性，準確性等綜合考慮在不同純化步驟中選用不同的檢測方法；

　　4、蛋白質緩沖液添加物，出于提高蛋白質穩定性，防止微生物生長，降低冰點或保持蛋白活性等，通常可以添加各種表面活性劑，金屬螯合劑，蛋白酶抑制劑，防腐劑，還原劑各種緩存成分等；

　　5、蛋白的儲存條件，保證活性的前提下，其最適的溫度，是否可以冰凍，反復凍融，儲存容器等；

　　純化前需要對序列信息進行研究，可以通過軟件分析間接獲取一些蛋白的基本情況屬性。在表達過程中，選用細菌，真菌，還是動物細胞系統更好，表達后是否保證其正確的翻譯修飾，克隆時選擇何種標簽更易過表達和純化都是需要考慮的問題。表達后提取物選用怎樣的過程進行細胞破碎，破碎過程中是否會引起蛋白變性，結構發生改變，是否會導致降解，穩定性發生變化等。純化過程中選用何種純化方式，如鹽析，有機溶劑沉淀，還是離心，電泳，層析柱等方法的選擇，通過粗提取，到精純，期間的純化順序直至最后的大規模批量化獲得。

　　生物信息學在蛋白質純化設計中的應用

　　通常可以得到以下信息：

　　1、多肽鏈的分子質量。

　　2、等電點PI，可以進行離子交換層析或者等電點沉淀方法進行純化，酸性蛋白質采用陰離子交換樹脂，堿性蛋白質采用陽離子交換樹脂，

　　3、摩爾消光系數，色氨酸，酪氨酸，二硫鍵等在280nm波長處有吸收值，通過摩爾消光系數可以計算蛋白質濃度。

　　4、半胱氨酸含量，決定是否在純化過程中添加DTT等還原劑。

　　5、二級結構，可以判斷傾向于形成α螺旋和β轉角等二級結構。

　　6、穩定性，可以預測蛋白質在體內的半衰期和不穩定性。

　　7、疏水區和跨膜區，可以用來找到潛在的跨膜區域，并且對功能未知的蛋白質，可以預測其是否為膜蛋白。

　　8、序列相似性暗示同源性和可能相同的輔因子親和性。可以檢索蛋白質數據庫以確定其是否與其他某個已知蛋白質具有很高的相似性。9、潛在修飾位點。可以判斷是否有糖基化位點，生物素化位點，金屬結合位點。

　　10、大腸桿菌中過表達蛋白質的可溶性。一個蛋白質在大腸桿菌過表達，可以通過序列預測是可溶的還是不可溶的包涵體。

　　但是通過蛋白質序列仍然無法得到更多精準的信息，例如蛋白質的三級結構，形狀，表面屬性，多亞基特征，同源多聚體或異源多聚體，沉降屬性等。因此通過蛋白質序列可以初步判斷一些純化策略，但更多時候蛋白純化還是經驗性的實驗工作為主。