蛹蟲草的繁殖栽培

　　栽培技術

　　育種

　　長期采用無性繁殖及多次轉管的蛹蟲草菌種，其母本基因容易變異，表現為出草畸形，產質量下降。因此，在生產中應定期對蛹蟲草菌種進行一次有性繁殖。具體做法是，選取高產、優質、早熟的蛹蟲草子實體，用0.1%升汞溶液，或75%的酒精進行表面消毒后，用無菌水清洗表面藥液，置于盛有綜合培養基容器上方懸空，在21℃-23℃下靜置培養，待培養基表面出現星芒狀蟲草菌落時，在接種箱內挑取單個或多個菌落置試管斜面培養基培養。待蛹蟲草菌絲布滿斜面后再提純。獲得的孢子母種須經出草比較試驗后，選取優質蟲草子實體再進行一次組織分離，經篩選后方可用于轉擴栽培種。

　　考種

　　將母種擴大培養后，置米飯培養基上，于18℃-20℃下培養20-30d，觀察生長情況。若見有細菌或霉菌污染，應對母種進一步純化；若無雜菌污染，可繼續培養，一個月后即有橙紅色子實體產生，說明母種可靠。

　　二級種子培養

　　將液體培養基分裝于500ml三角瓶中，每瓶加培養液200ml，用12層紗布外加一層牛皮紙封口。13-30分鐘滅菌后，將母種在無菌條件下用接種鉤接入三角瓶中，每支斜面可接10瓶以上。接種后于20℃搖床培養5d左右，待形成均勻小球后即可用于栽培種。

　　值得注意的是：如果培養液變混，有兩種可能性，一是細菌污染應予以淘汰；二是由于菌絲生長過分粘稠所致。若難以判斷，可進行鏡檢。

　　栽培流程

　　優選品種→制備培養基→蛹蟲草母種→二級菌種（藥瓶）→栽培蛹蟲草菌種→控制環境溫度與濕度→采收。[1]

　　菌種分離

　　（1）選革選擇生長正常、健壯、無病蟲害的新鮮蛹蟲草做分離材料。用野生早期生長（8月底以前出土的）蛹蟲草分離得到的蛹蟲草菌種具有明顯早熟性（即早出草）。菌種分離可采用泡子分離或組織分離等方法，生產上常用組織分離獲得純菌種或進行菌種復壯。[2]

　　（2）消毒將鮮蛹蟲草用清水洗去外表泥土，再用0．1%升汞水溶液消毒1-3分鐘，用無菌水沖洗數次，然后再用75%酒精浸泡3-5分鐘，用無菌水洗凈后進行分離。

　　（3）分離先用解剖刀切去蟲體外部，避開腸道，然后切取內部白色組織塊或子座內的組織塊，接種到斜面母種培養基上。以蛹蟲草子實體有龜背狀花紋的頂端組織獲得菌種種性最好。

　　（4）選擇抑菌培養基分離培養基最好采用加有50毫克/升鏈霉素的加富培養基。如采用其他培養基進行分離，在培養基中加入一定量的抑菌劑會提高分離效果。常用抑菌劑使用量和加入方法如下：鏈霉素 30-50毫克/升，滅菌后冷卻至 45℃時加入；金霉素 20-30毫克/升，滅菌后冷卻至 45℃時加入；青霉素 20毫克/升，滅菌后冷卻至 45℃時加入；牛膽汁 5克/升，配制時加入；孟加拉紅 35毫克/升，培養基煮沸時加入。

　　（5）培養分離接種后，在 20℃恒溫箱內培養 10天左右，挑選性狀良好的母種作為菌種。

　　（6）鑒定優良菌種標準是：菌絲白色，粗壯濃密，呈匍匐狀緊貼培養基生長，邊緣整齊，無明顯絨毛狀白色氣生菌絲，后期分泌黃色色素，菌絲見光后變為橘黃色。將分離菌種進行擴大培養后，接種在米飯培養基上進行出草和鑒定。于18℃-20℃溫度下培養20-30天，如果無污染則繼續培養，l個月后即可形成橙紅色子實體。經鑒定種性，選擇性狀優良菌種用于生產。

　　培養基

　　以大米、玉米等作主料，另添加10%-25%的蠶蛹粉或奶粉媽提高蛹蟲草子實體的品質。將培養料與營養液以1：1比例拌勻，pH值掌握在5.5-7.0。按常規裝瓶、滅菌、接種。

　　菌絲體培養

　　接種后的料瓶，應置于清潔、避光的環境中培養，保護空氣濕度60%。初始階段，為減少雜菌污染，室內溫室宜保持在15℃-18℃之間，待料面布滿蟲草菌絲后，將溫度提到20℃-23℃，持續15d左右，菌絲即可吃透培養料，完成營養生長。

　　培植技術

　　子實體培養

　　菌絲體成熟后，由白色逐漸轉為桔黃色，此時，室內應增加光照白，白天利用自然散射光，保持200勒克斯，晚間可利用日光燈作光源，每天應不少于10h光照，以促使菌絲體轉色和刺激原基形成。待料面突起，并形成小米粒狀原基時，要適當通風，補充新鮮空氣，保護室內溫度18℃-22℃，并提高空氣相對溫度至80%-85%。如濕度太大，易使培養基提早失水而影響產量。蛹蟲草有較強的趨光性，因此在子實體形成后，應根據情況適當調整培養瓶與光源的相對方向，或調整室內光源方向，以保證子實體的正常生長形態，從而提高產量，形成橘黃色或橘紅色的頂部略膨大的呈棒狀的子座(子實體)。待子實體不再生長，其頂端出現許多小刺時，表明已成熟。采收時，用無菌鑷子鉗出子實體，然后再加少許營養液，重新包扎好瓶口，繼續培養，20d左右，又可長出第二批子座。采收下的子實體晾干或低溫烘干后出售。暫不出售，應密封好置低溫干燥處貯存。

　　液體培養

　　蛹蟲草天然蛹蟲草資源稀少，人工固體栽培周期長，也不易控制條件。通過液體深層培養法獲得蟲草菌絲體絲體的化學組成與從天然采集的蟲草的化學組成接近，而且可以從發酵液中得到人們需要的物質，還能大大縮短生產周期。

　　蟲草菌絲的最適生長溫度為20~25°C。在進行菌絲發酵時碳源以蛋白胨為最優，采用1∶2或1∶3的碳氮比較為合適。

　　發酵最佳培養基組成是：5%大米粉、1.5%豆餅粉、1.5%麥芽粉、0.1%KH2PO4，0.05%MgSO4·7H2O。

　　影響蛹蟲草菌胞外多糖產量的實驗因子顯著性大小的排列順序為：甜菜糖>；酵母浸出粉>KNO3>MgSO4·7H2O>FeSO4>K2HPO4。胞外多糖最佳發酵工藝參數：初始pH值為7，500ml三角瓶中培養基裝液量為100ml，接種量6%，溫度28°C。周期為96h。

　　培養基配方為：玉米粉4%，黃豆粉0.6%，酵母粉0.3%，K2HPO40.05%，MgSO40.05%，接種量3%，pH5.5。認為碳源因子對胞外多糖的產生影響顯著。

　　蛹蟲草發酵的適宜培養基組成為：蔗糖5.0%，玉米漿3.0%，酵母膏0.5%，MgSO4·7H2O0.05%，KH2PO40.05%，認為蔗糖為碳源最好，以酵母膏為氮源，菌體產量最高。

　　蛹蟲草菌絲的生長可以利用多種碳源和氮源，在以紅糖碳源、奶粉為氮源的液體培養基中生長最佳，且碳源/氮源合適的比例為2.0~2.5/1.0，適宜PH為5.0~6.5。

　　培養基成分確定為蛋白胨1.5%，MgSO40.05%，KH2PO40.15%，VB15mg/L，2，4D2mg/L。在相同條件下，優化培養基比原來培養基的發酵得率提高了4.5%，研究初步得到蛹蟲草液體培養條件和生長動力學，為工業化生產提供了一定的理論依據。

　　培養基配比可將該菌株的蟲草素含量提高到1.21%，比用Czapek培養基提高8.1倍。柴建萍等通過實驗得出玉米粉為最優碳源，蠶蛹粉為最優氮源，MgSO4為最優無機鹽。液體發酵最佳培養基配方為：玉米粉（20g/1000ml），蠶蛹粉（5g/1000ml），硫酸鎂(0.5g/1000ml）。[3]