基于重復結構的融合蛋白大多為短肽，不具有復雜的空間結構，因此只需簡單的多肽合成過程即可獲得目標蛋白。由單個氨基酸合成多肽主要通過兩個氨基酸之間脫水形成肽鍵來實現，主要包括以下基本步驟:：首先對兩性離子結構的氨基酸進行相應的氨基或羧基保護，其次將羧基活化為活性中間體，待耦合過程結束后，對肽鏈上氨基酸的保護基團選擇相應的方式進行選擇性的脫除或者是全脫除。目前常用的多肽合成方法為液相合成和固相合成兩種。液相合成法是將所需的氨基酸配制成溶液，并對其中一個氨基酸的氨基、其余氨基酸的羧基和不參與反應的側鏈基團進行化學基團保護，只活化參加反應的氨基酸的羧基，待耦合反應完成后再將沒有參加反應的原料、活化劑等分離除去，得到純化多肽產物。這種方法雖然操作繁瑣，卻具有目標產物純度高的優勢。而固相合成法，則是將多肽序列C端的第1個氨基酸的羧基通過酯化反應固定于不溶性的樹脂上，進而以此氨基酸作為氨基組分，脫除其氨基保護基團并同過量的活化后的羧基組分耦合形成肽鍵，重復脫保護、縮合、洗滌過程持續合成，獲得所需的肽鏈。合成完成后，再試用三氟乙酸將產物從樹脂上切割下來，同時脫除所有保護基團，純化回收獲得所需多肽。
相對來說，具有一定空間結構且序列復雜的其他兩種融合蛋白的合成過程則復雜得多。精確構建所需DNA模版是保證融合蛋白多樣性及穩定性的基礎。在獲得目標DNA序列后，將其連接進入特定的載體之中，以獲得充足融合蛋白質粒。由于遺傳基因的簡并性，同一種融合蛋白可對應著多種DNA序列，但序列合成蛋白效率卻與擴增時選取的宿主種類有關( 大腸桿菌、酵母菌及真核細胞等) 。例如，“AAG 及AGA”片段如果出現在需要使用大腸桿菌表達體系的質粒中便會大大影響蛋白產率。重組質粒中密碼子的優化還有許多影響因素，密碼子偏倚、tRNA 可用性、mRNA 穩定性和mRNA 結構都在基因表達中起重要作用，而且選擇DNA片段時也應盡量避免在重組基因載體中存在高度重復的部分以避免發生錯配，影響mRNA 轉錄。