血栓學檢驗臨床應用中的幾個問題及其理解

血栓學檢驗標準化的幾個問題及其理解:伴隨著人們生活水平的提高，心血管疾病發病率和病死率也成逐年增高的趨勢，血栓栓塞性疾病做為多種系統疾病的并發癥成為臨床醫學的研究重點。近年來，血栓止血學臨床檢驗在出血性疾病的診斷、術前檢查和抗凝治療檢測中得到了廣泛應用。受益于檢驗醫學的迅猛發展，自動化凝血儀的普及大大提高了檢測效率，降低了系統誤差，使檢測結果的精密度和準確度達到前所未有的水平。然而，當前國內血栓學常規檢驗中仍然存在著一些誤區，除了方法學本身的問題之外，缺乏對項目和檢測原理的理解，也是造成目前參數使用不當、實驗室難以向臨床提供有力支持的主要原因。本文圍繞血栓學檢驗標準化內容從三個方面加以討論。

李健，副主任醫師，第三軍醫大學醫學學士，畢業后在解放軍總醫院先后從事臨床血液學、體液學和免疫學檢驗，先后參編《血細胞分析技術與臨床》、《貧血，血栓與遺傳學檢驗與臨床應用》和《當代血液分析技術與臨床》等七部學術專著。碩士期間于軍事醫學科學院參與國家863項目（2002AA2Z3411)資助的藥物代謝酶基因芯片的研究與制備，對芯片制備與信號檢測、探針和引物的設計合成及多重擴增有深入了解。博士研究師從叢玉隆教授，方向為抗血小板治療藥物耐受的血小板活化代償機制。近年來致力于抗栓溶栓藥物的臨床療效評估與實驗室監測標準化的相關研究。

伴隨著人們生活水平的提高，心血管疾病發病率和病死率也成逐年增高的趨勢，血栓栓塞性疾病做為多種系統疾病的并發癥成為臨床醫學的研究重點。近年來，血栓止血學臨床檢驗在出血性疾病的診斷、術前檢查和抗凝治療檢測中得到了廣泛應用。受益于檢驗醫學的迅猛發展，自動化凝血儀的普及大大提高了檢測效率，降低了系統誤差，使檢測結果的精密度和準確度達到前所未有的水平。然而，當前國內血栓學常規檢驗中仍然存在著一些誤區，除了方法學本身的問題之外，缺乏對項目和檢測原理的理解，也是造成目前參數使用不當、實驗室難以向臨床提供有力支持的主要原因。本文圍繞血栓學檢驗標準化內容從三個方面加以討論。

一、凝血檢驗的校準化與可比性

從PT和APTT檢測方法建立以來，相關學者就一直致力于這兩個參數的標準化，迄今為止，只有PT實現了部分標準化，也就是抗凝治療監測中INR系統的應用；而APTT的標準化仍然停留在探索階段。

（一)抗凝治療監測中PT的標準化  
由于凝血活酶試劑活性的差異以及報告方式的不同，抗凝治療的患者在不同實驗室得到的PT往往不具有可比性，不能用于抗凝治療藥物的調整。為此，1977年世界衛生組織將人腦來源的凝血活酶作為一級國際參考品（IRP)來校準凝血活酶試劑。并將PT以INR的形式表示，INR=（PT/MNPT)ISI，其中ISI為凝血活酶的國際敏感度指數，MNPT為正常人凝血酶原時間的幾何均數，這種校準方式大幅提高了手工檢測時不同試劑之間的檢測標準化。

（二)自動化凝血儀的多樣性使報告標準化再次面臨困境
INR的方式提高了實驗室質量控制的有效性和口服抗凝治療的安全性，在各大臨床指南中都可以發現以INR為監測目標的診治措施。今天，我們必須明確的是INR概念和校準方式的提出是基于手工方法的，當自動化凝血儀被普及使用之后，INR概念的內涵發生了更為復雜的改變。儀器測試原理與手工法顯著不同，對凝血活酶ISI以至INR產生較大的影響而且程度不確定，機械和終點判定等因素破壞了INR體系原有的可靠性和精密度。據文獻報道，同一廠家的相同機型對INR的影響都有顯著差異，儀器校正顯得十分必要。
必須明確：INR是WHO利用IRP標定凝血活酶試劑后，手工測定PT時優化報告的一種方法和理念，這時可以減少室間差異及提高報告的可比性。凝血活酶校準時要求使用參考品和試管傾斜方法判定結果，然而，將商品化凝血活酶在自動化凝血儀上檢測標本時，原理發生了改變，這種校準方法的基礎已經不復存在了。這時我們校準的不僅僅是凝血活酶，而是包括凝血活酶和檢測技術（儀器)在內的整個系統。
如果不用標準血漿校準，數據顯示實驗室間的INR差異具有顯著性，波動幅度（CV%)大約為9～17%，僅60%的實驗室在10%以內。即便使用同種試劑，同類型儀器測定的INR也有較大差異。原因之一就是很多研究誤以為ISI只針對試劑，實際上，一個固定的ISI未必適合所有機型，如果不考慮儀器差異而泛泛考察可比性，將導致試劑校準和系統校準的混淆。自動化凝血儀的檢測系統往往包括幾個部分：正常血漿、抗凝患者血漿、凝血活酶試劑、檢測技術（手工法和不同類型的凝血儀)。試劑對標本類型差異會產生不同反應，比如，某試劑在自動化凝血儀上與IRP手工法對比測定正常和高值兩組標本時，可能回歸曲線的斜率很接近，但是截距有差異，也就是試劑相關性較好，但是在不同值段的測定結果有差異。臨床實踐中不可能對正常和抗凝患者的標本建立兩條工作曲線，所以應盡量選擇性能表現均一的試劑。

（三)要嚴格限定試劑ISI的適用范圍
為了避免混亂，通過多年研究和專家的倡導，國外制造商已經在其說明書中提供儀器型號特異的凝血活酶ISI，便于用戶使用；但是要提供所有儀器和不同試劑組合的ISI顯然是不可能的。更讓人頭疼的是，制造商為每一批凝血活酶試劑提供的ISI不一定很準確，定標血漿使用不當進而導致INR的校準偏差。
凝血活酶制品校準的準確性取決于口服華法令患者標本的數量，WHO推薦的用IRP校準凝血活酶試劑的方法需要測定至少20份新鮮正常血和60份新鮮抗凝治療的血樣。許多廠家難于收集到足夠數量的標本，無法得到準確的ISI，受害的不單是實驗室，更多的是患者的利益。
是否選用同物種的IRP來校準凝血活酶，也是ISI標注的關鍵，人源和兔源IRP校準的凝血活酶在檢測性能上是不同的。1977年以后WHO陸續改良更新了幾個物種和不同級別的凝血活酶參考品，雖然WHO生物標準化專家委員會提出所有商品化凝血活酶都應以同一物種的國際參考品校準，甚至有專家認為應該都以人腦參考品校準，以減少物種之間的差異，但是據筆者觀察，多數產品說明書中都沒有校準方法的詳細表述，這就為單純追求低成本而不加選擇地換用試劑埋下了隱患。www.med126.com
此外還有生物參考范圍不同的問題。理論上，使用系統特異的ISI計算的INR應該是相當接近的，然而，由于校準方式不當和生物多樣性的存在，INR的值也有出入，比如各實驗室MNPT不同，凝血活酶生產商標定自己產品ISI時使用的方法不同等。
這些不利因素就對凝血實驗室提出了較高要求，但是自行校準也缺乏可行性。醫院測定MNPT還相對容易，但是按照WHO的推薦方法對凝血儀和試劑組成的系統來校準ISI并非易事。多數實驗室直接使用了試劑標注的ISI，甚至有的ISI不是針對自己的機型。而且即便是校準了ISI，也只能出來報告之后再編輯程序批量計算校準后的INR。據筆者了解，目前在國內主流機型上通過調整ISI實現系統校準難度較大。因此，要么在實驗室信息系統（LIS)中增加數據處理的程序語句，要么計算INR后再手工輸入，這種方式推行起來有困難。

（四)止凝血檢驗中的校準和定標辨析
先是校準試劑，接著又校準試劑和儀器所組合成的系統，但是，我們仍然沒有全面考慮到包括測試環境的所有因素。比如說粘度法中磁珠的差異，離心比濁法儀器中離心力的差異，光學比濁中的光徑，凝集曲線的特異性，電子和機械部件上差異等等，不一而足，任何因素不一致都會使結果受到影響。任何一種方法的結果都是根據定標曲線和檢測信號確定的，儀器之間不僅信號不同，定標曲線更是千差萬別。盡管常規工作中的定標通常表述為Calibration，但是這并不是嚴格意義的校準。定標曲線的建立是為了在本實驗室環境下保持檢測體系穩定的一種方式，只是一個檢測平臺，用于保證實驗室對某一人群標本測定的一致性。這個過程中沒有真正的標準品出現，如果定標血漿未經IRP校準，那么該定標是不能溯源的，定標后的不同儀器未必具有可比性，系統差異的存在也不能通過定標來消除。由于儀器性能上的差異性，簡單地用校正因子來調整檢測系統的方法是無效的。
APTT的標準化進程更為困難。檢測系統類型、接觸活化因子以及試劑磷脂成份的差異會導致APTT反應的差異。1995年國際上提議建立APTT標準化的校準模型，而目前還沒有適用于APTT的國際標準品，1998年Van Den Besselaar教授提出可以將含有合成磷脂和膠質硅的凍干APTT試劑作為候選的APTT國際標準品。Clauss法Fib定量的定標曲線可以溯源到參比血漿，因此這種方法可以實現標準化, 而PT衍生法是根據濁度變化換算結果，不僅與真實濃度存在偏差而且也不能標準化。

（五)實現止凝血檢驗標準化過程中的有益嘗試
可以說，凝血檢驗的標準化仍然在不斷完善的過程中，一方面我們要強調其必要性，另一方面也需針對實驗室的具體條件靈活處理，提出相應的解決方案。大致可以分為以下幾個層次：（1)盡可能使用ISI接近1.0的PT試劑，這種情況下可以使用廠家提供的ISI。或者選擇廠家標注了本實驗室機型相應ISI的試劑，這時也盡量選擇ISI較小的劑型。針對特定的儀器和凝血活酶試劑組合，使用系統特異的ISI，系統特異的ISI與單一ISI相比變異性更低，因此選擇儀器和試劑時應予以考慮。（2)如果ISI接近2.0而且沒有配套凝血儀，又無從獲得口服華法林病人的血漿，應該用商品校準血漿調整本室ISI。用商品化凍干質控血漿校準檢測系統，需要注意血漿來源，不同凝血活酶試劑對人為消耗生成的低凝血漿和口服抗凝藥后患者的低凝血漿是有反應差異性的。使用多個獻血員的混合血漿與單一血漿相比可以減少生物變異性，減少線性回歸時數據的離散。(3) 用國際標準品使PT標準化。標本的INR低于4.0時，使用廠家標注的ISI和實驗室重新校準的ISI計算的INR具有良好的相關性，但是高于4.0時則會產生較大的偏差，這種偏差在臨床上會形成足夠的臨床意義干擾正確的治療。國外已經出現了多種標注了INR的商品化質控血漿用于確認檢測程序，假如所有的凝血活酶制劑都根據WHO推薦的方法正確地校準過，那么用這些凝血活酶測定質控血漿時結果應該是一致的，測得的INR與標注的INR相符，事實上，只有用同一廠家出品的質控血漿和凝血活酶才能得到和標注值吻合的結果。換用其他凝血活酶試劑或者將凝血活酶試劑的ISI重新校準后，INR與標注值相去甚遠。因此質控血漿的使用尚需慎重，避免誤導用戶認為自己的檢測系統不準確。比較好的辦法是使用20個參照IRP用手工法標定PT值的凍干血漿校準品對實驗室檢測系統進行校正。

綜上所述，可以認為自動化凝血檢測系統具有相互獨立性，儀器之間不存在標準問題。選擇儀器時我們應該考慮那些與手工測定結果接近的和INR變異小的設備。盡管我們一直嘗試著校正自動化凝血儀，但是以何為準呢，這個標準就應該是手工參考方法，通過這種方法獲得標準品的參考值，再對檢測體系加以調整，使儀器測定的INR接近該值。

二、纖維蛋白原的Clauss法與PT衍生法測定差異

纖維蛋白原（Fib)除了診斷低纖維蛋白原血癥和溶栓監測等之外，可以作為累及動脈的心血管事件的預測指標，因此用于篩查時就需要足夠標準化和良好的重現性，以便于臨床判斷或解釋。選擇哪種方法用于纖維蛋白原定量測定可以說是老生常談了，除了Fib抗原分析之外，在臨床常規分析中無疑是Clauss方法，但是目前仍有為數不少的臨床實驗室用PT衍生法的計算值報告結果，并由此產生了室間質控甚至臨床報告的顯著偏差，考慮到本刊讀者群體對臨床實際問題的密切關注，我們簡單探討一下PT衍生法Fib（PT-Fib)與Clauss法之間的差異，以及這種差異可能帶來的后果。

從某種意義上說，Clauss法Fib測定是臨床凝血檢驗中唯一能夠實現標準化的指標，即便是使用不同試劑在不同儀器上測定，都應具有良好的一致性。當然，前提是在方法學不受影響的前提下，比如光學法儀器測定乳糜標本時，會因為濁度較大發生結果偏差。用clauss法測定參考品或可溯源的質控品時，不同試劑的結果之間一致性非常好，甚至來自于不同實驗室的結果之間差異都不顯著，從這一點說，參加室間質評時，如果是基于clauss方法，而且在本機上有較好的定標，那么至少Fib這一項是不該失控的。但是臨床標本不同于參考品，特別是溶栓治療的患者標本，其變異性會略高。

臨床評估發現，測定高值標本時。與clauss法相比，PT-Fib的測定值偏高，而且對校準血漿有依賴效應，它不僅受標本濁度影響，也會因儀器原理或凝血活酶差異產生較大的離散。PT檢測是光散射法還是光密度法，反應終點的判斷方式如何，都是造成PT-fib不具有可比性的原因。一般地說，PT-FIB測定結果略高于Clauss-Fib，兩者之間呈曲線關系，而且隨著FIB濃度的增高，方法之間的差異會有所波動，最大差距甚至可達2g/L。在異常纖維蛋白原血癥和溶栓時，Clauss法Fib已經減低時，PT-Fib卻仍然表現為正常。不得不提起注意的是，PT-Fib不僅是儀器之間，在同一系列不同型號的儀器之間也存在差異，比如同樣是光散射法原理定標測定，如果使用了不同系列的反應杯，就會出現散射光與濃度之間的定量關系發生變化，進而出現結果的不一致性。
除了PT-fib的結果略高于Clauss法之外，還有一個特點，即不同試劑測定的結果相關性非常好，但是有可能一種試劑的結果可能明顯高于另一試劑。因此，我們在臨床評估時，單一依靠相關性來說明新試劑是否可靠或有效的做法是欠妥當的，起碼纖維蛋白原這一定量指標應該引入準確度的概念，也就是說不同試劑測定纖維蛋白原時應該使用Clauss直接比較差異性（因為相關性已經成為前提)。

由于纖維蛋白原濃度減低比增高的臨床意義較大也更為常見，因此多數Fib診斷試劑主要針對低水平Fib定量，甚至定標血漿濃度僅略高于4g/L，這就決定了測定高值標本時的靈敏度和特異性是不同的。從這個概念上說，選擇FIB定標血漿顯得尤為重要，作為臨床實驗室來講，不便于獲得國際標準品，多數使用的是廠家提供的定標血漿，由此就帶來了產品差異性。

Clauss法尚且能夠用參比血漿或其衍生定標血漿來保證不同體系測定的準確性，而有些PT-fib是根本不能定標的；甚至個別方法連高值血漿Fib的濃度都不能設定進去，這是因為儀器內部的參數限制，Fib太高用該方法難以得到定標曲線。英國血液學會在纖維蛋白原測定指南中指出：推薦使用Clauss法纖維蛋白原測定。結合我們的臨床經驗，不推薦用PT-Fib進行試劑或儀器性能比對，特別是在一些重要血栓性疾病時，比如DIC、溶栓、口服抗凝藥或高纖維蛋白原血癥時，方法學的差異將表現得非常明顯。