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  • 發布時間:2020-08-17 10:10 原文鏈接: 血清脂蛋白瓊脂糖電泳實驗

    實驗方法原理 血清脂蛋白經蘇丹黑B染色后,以瓊脂糖為載體,在pH8.6巴比妥緩沖液中進行電泳,可將脂蛋白分成不同的區帶。按電泳移動的速度不同,正常人血清脂蛋白可出現三條區帶,從陰極到陽極依次為β-脂蛋白(最深)、前β-脂蛋白(最淺)、α-脂蛋白(比前β-脂蛋白略深些)。在原點處應無乳糜微粒,也見不到中間脂蛋白的條帶,有時前β-脂蛋白也顯示不出來。


    前β-脂蛋白比α-脂蛋白深染,且血清甘油三酯明顯升高,膽固醇正常或略高,可以確定為Ⅳ型高血脂癥。


    β-脂蛋白區帶比正常明顯深染,血清總膽固醇明顯增高而甘油三酯正常者為Ⅱa型高血脂癥,血清總膽固醇增高而甘油三酯略高和前β深染者則為Ⅱb型高血脂癥。


    β和前β-脂蛋白兩條區帶連在一起彼此難以區分稱為“寬β區帶”,同時血清甘油三酯和膽固醇均有增高,可定為Ⅲ型高血脂癥。


    原點出現乳糜微粒,β和前β均正常或降低,同時血清甘油三酯明顯增高,可定為Ⅰ型高血脂癥。

    實驗材料 血清

    試劑、試劑盒 蘇丹黑B染色液巴比妥緩沖液Tris緩沖液

    儀器、耗材 瓊脂糖凝膠水平電泳設備載玻片離心機水浴鍋

    實驗步驟

    一、試劑


    1.血清。


    2.蘇丹黑B染色液 蘇丹黑B的飽和無水乙醇溶液,用前過濾。


    3.巴比妥緩沖液(pH8.6,離子強度0.075)為電極緩沖液。巴比妥鈉25.4g,巴比妥2.76g,EDTA酸0.292g,加水溶解后用水稀釋至1000mL。


    4.Tris緩沖液(pH8.6)為凝膠緩沖液。Tris1.212g,EDTA酸0.292gNaCL5.85g,加水溶解后再加水至1000mL。


    5.瓊脂糖凝膠 瓊脂糖0.45g,Tris緩沖液50mL,加水50mL,邊攪拌邊加熱至沸騰,待瓊脂糖溶解后立即停止加熱。


    6.水平電泳設備。


    7.37℃水浴。


    8.離心機。


    9.載玻片


    10.切口刀 刀口長15mm的刀片兩片,中央夾一有機玻璃或木片,用螺絲固定,使兩片刀片相距1.5mm。用相應的打槽器更好。


    11.挖槽小匙 用直徑1.5mm的銅絲約6cm長,一端錘成扁平,用細砂紙磨光(用剪好的X光片亦可)。


    血色素管或微量加樣器。


    二、操作步驟


    1.預染血清 血清0.2mL加蘇丹黑B染色液0.02mL于小試管中,混合后置37℃水浴染色30分鐘。然后2000r/min離心5分鐘。


    2.制備瓊脂糖凝膠板 將已經配置的0.45%瓊脂糖凝膠置于沸水浴中加熱融化。用吸管吸取凝膠溶液澆注載玻片,每片約2.5mL,靜置約半小時后凝固(天熱時需延長,或放冰箱數分鐘加速凝固)。


    3.點加血清 在已經凝固的瓊脂糖凝膠板距離一端約2cm處,用切口刀片(打槽器)垂直切入凝膠后立即取出,然后用銅絲小匙將長方小條凝膠取出。以小片濾紙吸干小槽內水分,用血色素吸管吸取經過預染的血清約15μl,注入凝膠板上的小槽內。


    4.電泳 將加過血清的凝膠板平行放于電泳槽中,樣品放于陰極一端。兩塊三層紗布于巴比妥緩沖液中浸濕,然后輕輕緊貼在凝膠板兩端,紗布的另一端浸于電泳槽內的巴比妥緩沖液中(注意:此電極緩沖液不能用三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替)。接通電源,電壓為120~130V,每片電流為3~4mA。約經45至55分鐘,即可見到分離的色帶。


    注意事項

    1.電泳樣品應為新鮮的空腹血清。


    2.加熱溶化瓊脂時,須防止水分蒸發過多。瓊脂凝膠最好隨用隨制,以免凝膠表面干燥,影響分離結果。


    3.在α-脂蛋白前若出現較淺區帶,可列為α-前脂蛋白。


    4.如果要保存電泳圖形,可將凝膠板(連同玻片),置于清水中浸泡2小時脫鹽,而后放入干燥箱(80℃左右)烘干即可。


    5.制作凝膠板是瓊脂糖濃度一般選用0.5%左右為宜,高于1%以上α-脂蛋白部分較緊密,β-和前β-脂蛋白部分不夠清晰,低于0.45%則凝膠凝固性較差,圖譜不清。


    6.樣品槽要大小適宜,邊緣整齊、光滑,否則會影響電泳圖形。


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