血清蛋白的瓊脂糖凝膠電泳

實驗概要

本實驗介紹了血清蛋白瓊脂糖凝膠電泳的原理及操作步驟等。

實驗原理

瓊脂糖（agarose）是經過挑選，以質地較純的瓊脂（agar）作為原料而制成的。瓊脂在化學上是由瓊脂糖和瓊脂膠組成的復合物。瓊脂膠是一含有硫酸根和羥基的多糖，它具有離子交換性質，這種性質會給電泳及凝膠過濾以不良的影響。瓊脂糖是直鏈多糖，它由D－半乳糖和3,6－脫水－L－半乳糖的殘基交替排列組成。

瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大（98－99%），近似自由電泳，因為固體支持物的影響少，故電泳速度快，區帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團，電滲影響很少，是一種較好的電泳材料，分離效果較好。

血清中脂類物質與血清載脂蛋白結合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數量不同，各種脂蛋白顆粒大小也相差很大，因此，以瓊脂糖凝膠為支持物，在電場中可使各種脂蛋白顆粒分離開來。

瓊脂糖凝膠電泳分離血清蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑（或油紅等）進行預染。再將預染過的血清加樣于瓊脂糖凝膠板加樣槽中，通電后可以看到脂蛋白向正極移動，并分離出幾個區帶。正常人血清脂蛋白可出現三條區帶，從陰極到陽極依次為β－脂蛋白（最深），前β－脂蛋白（最淺）及α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些），在原點處應無乳糜微粒。有時前β－脂蛋白也顯示不出來。

瓊脂糖主要通過氫鍵而形成凝膠。電泳時因凝膠含水量大（98－99%），近似自由電泳，因為固體支持物的影響少，故電泳速度快，區帶整齊。而且由于瓊脂糖不含帶電荷的基團，電滲影響很少，是一種較好的電泳材料，分離效果較好。

血清中脂類物質與血清載脂蛋白結合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數量不同，各種脂蛋白顆粒大小也相差很大，因此，以瓊脂糖凝膠為支持物，在電場中可使各種脂蛋白顆粒分離開來。

瓊脂糖凝膠電泳分離血清蛋白方法簡單。將血清脂蛋白用脂類染料蘇丹黑（或油紅等）進行預染。再將預染過的血清加樣于瓊脂糖凝膠板加樣槽中，通電后可以看到脂蛋白向正極移動，并分離出幾個區帶。
正常人血清脂蛋白可出現三條區帶，從陰極到陽極依次為β－脂蛋白（最深），前β－脂蛋白（最淺）及α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些），在原點處應無乳糜微粒。有時前β－脂蛋白也顯示不出來。

主要試劑

1. 蘇丹黑染色液　　

將蘇丹黑B加到無水乙醇中至飽和，搖蕩使乙酰化。用前過濾。
2. 巴比妥緩沖液　　

稱取巴比妥鈉15.4g、巴比妥2.76g及EDTA0.29g，加水溶解后再加蒸餾水至1000mL（pH為8.6，離子強度0.075），為電極緩沖液。
3. 凝膠緩沖液　　

取三羥甲基氨基甲烷1.212g、EDTA0.29g及NaCl5.85g，用蒸餾水溶解后，稀釋至1000mL，pH為8.6。
4. 瓊脂糖凝膠　　

稱取瓊脂糖0.45 g溶于50 mL凝膠緩沖液中，再加水50 mL。在水浴中加熱至沸，待瓊脂糖完全溶解后，立即停止加熱。

主要設備

1. 37℃水浴鍋

2. 高速離心機

3. 吸管

4. 載玻片

5. 低溫冰箱

6. 毛細管

7. 電泳設備

8. 80℃烘箱

實驗材料

血清

實驗步驟

1. 預染血清　　

血清0.2mL中加蘇丹黑染色液0.2mL，混合置37℃水浴中染色30分鐘，離心（2000轉/分）約5分鐘。以除去懸浮于血清中染料沉渣。
2. 制備瓊脂糖凝膠板　　

將已配制好的0.5%瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化，用吸管吸取凝膠溶液澆注在載玻片上，約3 mL。靜置半小時后凝固（天熱時需延長，也可放入冰箱中數分鐘以加速凝固）。
3. 點樣　　

將剪好的濾紙條對折，以折邊在距凝膠一端50px處切一點樣口。將毛細管插入預染好的血清中，待吸入部分血清后，取毛細管使其有樣品的一端靠于點樣口端部，停靠3秒左右。
4. 電泳　　

將凝膠板平放入電泳槽中，使加樣端接在陰極一側，用四層濾紙或紗布做成“引橋”，敷于膠板的兩端，各搭住凝膠板約25px左右，“引橋”的另一端浸于電泳槽內的巴比妥緩沖液中。接通電源，首先調節電流為3-4mA/凝膠板，電泳10－15分鐘；然后調節電流為6-7mA/凝膠板，電泳30－40分鐘，即可觀察到分離的區帶。
5. 如果需要保留電泳圖譜，可將電泳后的凝膠板（連同載玻片）放入清水中浸泡脫鹽2小時，然后放烘箱（80℃左右）中烘干即可。

注意事項

1. 電泳樣品應為新鮮的空腹血清。
2. 加熱溶化瓊脂時，須防止水份蒸發過多。瓊脂糖凝膠最好隨用隨制，以免凝膠表面干燥，影響分離效果。
3. 制作凝膠板時瓊脂糖濃度一般選用0.5%左右為宜，高于1%以上α－脂蛋白部分較緊密，β和前β－脂蛋白部分不夠清晰；低于4.5%則凝固性較差，圖譜不清。
4. 點樣口要大小適宜，邊緣整齊、光滑，否則會影響電泳圖譜。
5. 在α－脂蛋白前若出現較淺區帶，可列為前α－脂蛋白。
6. 正常參考范圍
α－脂蛋白20~30%
β－脂蛋白 20~30%
前β－脂蛋白 0~28%
乳糜微粒（-）