血清LDL－C自動化分析方法的研究進展

  關于 lDL－C的測定方法，目前常用的有聚乙烯硫酸鹽化學沉淀法（ pVS法）、肝素檸檬酸納化學沉淀法（ hCS法）和 friedewald公式計算法（ f公式法），另外還有 nCEP推薦的參考方法即超速離心─化學沉淀法（ bQ法）和瓊脂糖電泳染色法。上述方法中，選擇性沉淀法需預先沉淀分離，其中 pVS法在 tG＞4g/L時，結果明顯偏低， hCS法的準確性依靠于精確的 pH（5 11），F公式法在 tG＞4g／ l時，估算值準確性差，且需要總膽固醇、 tG和 hDL－C的準確測定值，影響因素較多，而超速離心─化學沉淀法（ bQ法）和瓊脂糖電泳染色法既麻煩又費時，不適合臨床實驗室。近年來隨著自動化分析儀的日益普及，研制開發適用于自動化分析的 lDL－C直接（ direct）測定法已是當務之急，本文就 lDL－C的自動化分析方法的研究進展作一綜述。     1免疫分離法

1995年 mcnamara jR等利用 sigma公司提供的由 genzyme公司發明的 direct LDLTM試劑盒直接測定血清中的 lDL－C，該法是通過使用包被有高親和力的羊抗人 apoAI和 apoE多克隆抗體的聚笨乙烯膠乳，用一種特制的具有離心過濾裝置的雙層試管，當一定量的血清和已包被有抗體的聚苯乙烯膠乳懸液被加入到雙層離心試管中，使 apoAI和 apoE抗體與血清中的 cM、 vLDL、 lDL和 hDL發生作用，然后1500g離心5min，免疫沉淀的 cM、 vLDL、 iDL和 hDL被過濾裝置截留在內層小試管內，含有 lDL的濾液被外層試管回收，通過酶法測定濾液中膽固醇的濃度，即可得出 lDL－C的含量， mcnamara JR等對該法的研究結果表明：分別用本法（ y）和超速離心法（ x）測定115例禁食、非禁食脂代謝異常的患者血清標本，，兩種方法相關性良好， y＝08x 0182，r＝097，n＝115。本法批內 cV為12%～38%，批間 cV為20%～51%。用本法可以測定隨機非禁食標本和中高度 tG水平標本，且準確度能達到 cDC所要求的 lDL－C準確度≤±5%的標準，表明免疫分離法是一種簡便準確的 lDL－C直接測定方法，但該法僅適用于新鮮血清標本，冰凍標本隨冰凍時間的延長而產生逐步增加的負偏差。1997年， maitra a等對 lDL－C直接測定法（ d－LDL）也進行了較系統的研究，他們對156名正常人和高 tG患者，分別用 l－LDL、 d－LDL和參考方法 bQ－LDL超速離心─化學沉淀法，三種方法進行 lDL－C水平的測定，其中 d－LDL法即免疫分離法（試劑盒由 sigma公司提供）， l－LDL法是由 poly－medco提出的一種選擇性化學沉淀法。結果表明：以國際公認金標準 bQ－LDL法為參考方法，在 tG＜4g/L時，三種方法間呈現良好的相關： l－LDL＝11BQ 003， r＝095， x＝132mmol/L， y＝146mmol/L， sy/x＝014， n＝106； dLDL＝098BQ－001， r＝097， x＝132mmol/L， y＝129mmol/L， sy/x＝01， n＝106；在 nbstG≥4g／ l時，三種方法同樣相關良好： l－LDL＝097BQ 037， r＝091， x＝123mmol/L， y＝156mmol/L， sy/x＝018， n＝50； l－LDL和 dLDL法對 bQ－LDL法的平均偏差分別為127%和62%。三種方法在測定禁食和非禁食標本時，結果無顯著差別，于1995年 jialal i等的研究結果相近。提示： dLDL法比 l－LDL法更具有優越性，是常規測定 lDL－C的較好的方法，該法也適用于高脂血癥兒童標本的分析。 

   2比濁法

1983年， burtl等【11】設計的固定時間動態化學比濁快速測定法，用肝素、 ca2 、 eDTA特異性地沉淀 lDL而產生濁度，以脂肪酶法去除 vLDL干擾。該法主要是測定 lDL總體顆粒而不是 lDL－C，但可用已知 lDL－C值的參考血清的濁度計算出標本中 lDL－C的濃度，其結果同 f公式間接計算法或 lRC超速離心法相關良好。1997年岳秀玲【12】報道利用免疫比濁法測定血清中 lDL－C，其測定原理是血清中 lDL抗原與試劑中羊抗人 lDL抗體作用，形成抗原抗體復合物，并產生濁度，該濁度的高低在過量抗體存在時，與抗原（ lDL）的含量成正比，同時，由于反應液中含有穩定劑可使非 ag－Ab復合物（如脂類、大分子蛋白多聚物等）消濁，而消除非特異性干擾，用已知 lDL－C值的參考血清的濁度計算出待測標本中 lDL－C的濃度。結果表明：本法批內 cV＝26％，批間 cV＝55％，與 pVS選擇性沉淀法比較兩法相關良好， r＝086。但本法結果較 pVS法明顯偏低， p＜005。試法簡便、快速，既適用于手工操作，更適合于全自動生化分析儀。但 kerscher等【13】指出測定完整的 lDL顆粒還不能像 lDL－C那樣做為一個明確參數，以 lDL顆粒的量估計 lDL－C可能受到 lDL顆粒中膽固醇含量個體差異的影響。 

    3選擇性測定法

日本第一化學藥品株試會社推出 lDL－C直接測定試劑盒，該試劑盒為液體雙試劑盒，適用于各類自動生化分析儀，在無需標本預處理的情況下，實現 lDL－C自動化分析。該法原理【14】是試劑1中的表面活性劑可使樣品中的 hDL、 vLDL和 cM顆粒解離，膽固醇分子被釋放出來，立即同膽固醇酶試劑反應，產生的 h2O2在缺乏偶聯劑時被消耗而不顯色，此時 lDL顆粒仍是完整的，加入試劑2（含另一種表面活性劑和偶聯劑），它可使 lDL顆粒解離釋放出膽固醇，在膽固醇酶試劑的作用下，產生 h2O2，參與 trinder反應而顯色，色澤的深淺與 lDL－C的含量成正比，通過與相應的標準品（ lDL－C的校正物）比較，計算出樣品中 lDL－C的含量。本法的分析不精密度＜5％，符合 nCEP的要求，因簡便、快速、準確，適用于自動化分析，是一種很有發展前途的 lDL－C直接測定法。

小結：上述三種方法中，免疫分離法盡管稱為直接測定法，但仍需將血清用連接有抗體的聚苯乙烯膠乳免疫分離預處理過程，且本試劑價格昂貴，免疫比濁法，簡便、快速、成本低，適用于自動化生化分析儀。選擇性測定法簡便快速、微量準確，可適用于具有雙試劑加樣功能的各類自動化分析儀，是比較理想的 lDL－C自動生化分析方法，但目前尚無國產試劑，由于進口試劑價格昂貴，限制了本法在國內的廣泛應用。 
 參考文獻

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13 Kerscher l， Schiefer S， Draeger B， et al， Clin Biochem ，1995;18：118－225

14日本第一化學藥品株式會社說明書