1. 將心臟放入盛有約 5 ml HBSS/PS（HBSS，添加 150 U/ml 青霉素和 150 μg/ml 鏈霉素） 的 Petri 培養皿。
2. 除去主動脈和肺動脈等與心臟相連的血管。
3. 將心臟（小鼠心臟：放入含有 300 U/ml 青霉素和鏈霉素混合液、50 μg/ml 慶大霉素的 HBSS/PSG）切成兩半，取出較大的血塊和掉落的結締組織。
4. 將心臟放入盛有 CMF （不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS，添加 150 U/ml 青霉素和 150 μg/ml 鏈霉素胰蛋白酶和 EDTA 混合液（如Sigma））的 Petri 培養皿，沖洗后換人新鮮 CMF 。
5. 用手術刀將培養皿中的標木切成小塊。
6. 將組織塊懸起，再讓其沉下，由此用 CMF 洗組織塊。
7. 用手術刀片取組織塊，然后移入盛有 10 ml 現配制的溫膠原蛋內酶 A （膠原蛋白酶A : 是從溶組織梭狀芽孢桿菌提純的（103586，Roche）。1 mg/ml，用 HBSS 配制 10 ml。用時現配，過濾滅菌）（1 mg/ml）的容器。
8. 在 37°C 條件下孵育 30 min，同時攪動組織塊。
9. 加入 CMF。
10. 搖動組織塊，然后讓其沉下，由此分散細胞。將細胞懸液移人試管。
11. 重復步驟 9 和步驟 10 幾次。
12. 將細胞懸液離心（300 g，8 min）。
13. 輕輕吸去上清液，避免攪動細胞。
14. 用 5 ml 胰蛋白酶和 EDTA 混合液將細胞混懸，通過用吸管吹打將成團的細胞分散，然后在 37°C 條件下孵育 10 min。
15. 將 10 ml 含 1 % FS 的 HBSS/FB 加入已消化的組織和細胞，用孔徑為 70 μm 的細胞濾器過濾。 .
16. 用 20 ml 冷 HBSS/FB 沖洗細胞濾器內的組織。
17. 將濾液中的細胞離心（300 g，8 min）。
18. 輕輕吸去上清液，保留細胞。
19. 加入約 5 μg 無相關抗體（如 OKT4/OKT8），輕彈試管以分散細胞。在冰上孵育 20 min，阻斷 Fc 受體。
20. 加入 5 μg 大鼠抗小鼠內皮糖蛋白（endoglin）抗體（克隆 MY7/18），輕彈試管，在 4°C 條件下孵育 20 min。
21. 加入 30 ml HBSS，在 4°C 條件下離心（300 g，8 min）。
22. 加入 50 μl 山羊抗大鼠免疫微珠（用 20 μl HBSS 配制）。
23. 在 4°C 條件下孵育 15 min。
24. 加入 30 mlHBSS，洗免疫微珠，然后在 4°C 條件下離心（300 g，8min）。
25. 按照生產廠家的說明，將 MidiMacs 柱放在磁體上，用 500 μl 含有 1 % FCS 的 HBSS 洗 MidiMacs 柱。
26. 將 3 ml 含有 1 % FBCS 的 HBSS 加入試管，然后將微珠懸液加入 MidiMacs 柱。
27. 用 1 ml HBSS/FB 洗 3 次，隨后用 500 μl 生長培養液洗。
28. 取出 MidiMacs 柱，放入 15 ml 試管，然后加入 4 ml MCEC 生長培養液（MCEC 生長培養液：含有 25 mmol/L 葡萄糖和 4 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM，添加 10 % FBS、150 U/ml 青霉素、150 μg/ml 鏈霉素和從牛腦提純的內皮細胞生長添加劑（endothelial cell growth supplement，ECGS））。放入柱塞，收集結合于微珠的細胞。將細胞懸液移人明膠預涂的 25 cm2 培養瓶。
29. 為了保存非內皮細胞，將 MidiMacs 柱的洗液離心，接種于 25 cm2 培養瓶，用添加 15 % FBS 的 DMEM （含有 1000 mg 葡萄糖）培養。
維持培養
30. 每周換培養液 2 次。如果細胞單層 <50 % 時半換液。如果細胞單層達 50 %~ 80 % 時，全部換液。
31. 細胞單層達 80 % 時，用胰蛋白酶和 EDTA 混合液消化后按 1 : 3 傳代。
32. 不要用超過 3 代的細胞。 展開 | 