補體C2遺傳多態性檢測與平皿法測定補體C2

一、補體C2遺傳多態性的檢測
 
人類補體C2基因位于第6號染色體短臂的HLA區，與Bf緊密連鎖。C2、Bf、C4共同構成補體單倍型，C2的缺乏可導致一些疾病的發生。C2的遺傳多態性主要為C2*C（C：common）、C2*B（B：basic）、C2*A（A：acidic）、C2*QO（QO：Quantify Zero）四種同種異型。
 
聚丙烯酰胺等電聚焦及溶血覆蓋檢測C2遺傳多態性
 
1、原理 等電聚焦是根據所測蛋白質等電點的不同，將各類蛋白質分離開。C2等電點（p1）為5.5，通過等電聚焦電泳，C2條帶可出現在兩性電解質pH 5.2～5.7的范圍內，繼而加以溶血覆蓋，C2條帶區可出現透明溶血帶，根據C2溶血帶出現的區域，判別C2的同種異型。
 
2、所需試劑的配制
 
（1）Acryl sol A 牛磺酸33.30g、丙烯酰胺66.60g、雙丙烯酰胺1.60g，加水至幾，過濾，放棕色瓶，4℃保存；
 
（2）pH7.3VBS（5X） 巴比妥鈉1.019g，NaCl 8.30g，先溶于150ml蒸餾水中，加HCl（1mol/L）3.46ml，最后加蒸餾水至200ml；
 
（3）2%明膠 明膠2g，疊氮鈉0.02g溶于100ml蒸餾水中，4℃保存；
 
（4）GVB2+（明膠巴比妥緩沖液） VBS2+ （5X）20ml，0.03mol/L CaCl2 2ml，0.1mol/LMRCl：2ml，2%明膠10ml，加蒸餾水至100ml；
 
（5）GL-GVB2 GVB2+ 1份與10%葡萄糖溶液1份混合；
 
（6）PB pH6.0，u=0.1 NaH2P04·2H20（MW 156.01）13.17g，Na2HP04·12H20（MW358.16）1.86g，加水至1L；
 
（7）PBS pH6.0 0.85%NaCl 980ml，PBpH6.0/L：0.1m20ml；
 
（8）5X10-5mol/L 12溶液 先配制10-2mol 12溶液，稱取8.3g KI，0.25g 12，加4mlpH6.0,u=0.1的PBS，待I2溶解后，再加PBSl00ml。取10-2mol l2 5ml加PBS 995ml；
 
（9）0.2mol磷酸 取1.35ml磷酸加水至100ml；
 
（10）0.2mol乙醇胺 取乙醇胺1.22ml，加蒸餾水至100ml；
 
（11）0.001%核黃素 稱取核黃素10mg，加蒸餾水至1L，儲于棕色瓶中，4℃冷藏；
 
（12）1%曲拉通（冷卻用） 取曲拉通10ml，加蒸餾水990ml；
 
（13）兩性電解質（ampholine，LKB） pH5～8和pH3.5～10兩種；
 
（14）無C2人血清（R2）的制備 將3份以上正常人血清混合，1:100稀釋的正常人血清，C2將不能發揮作用。
 
3、操作步驟
 
（1）制膠 將Acryl SolA 40raL,0.001%核黃素10.8ml，pH5—8的兩性電解質2ml、pH3.5～10的兩性電解質0.4ml混合后，倒入15X10cm，厚度為lmm的兩塊玻璃板中（中間夾有lmm厚的有機玻璃框，四周用鋏子夾住，不漏水），放日光下或兩只40W日光燈下聚膠2—5m/n，然后揭掉一塊玻璃板。
 
（2）等電聚焦電泳 ①將濾紙裁成寬0.65cm長15cm的紙條，疊成四層作為電極條，再將濾紙裁成寬0.5cm，長1cm的紙條，單層作為加樣條；②將凝膠板放在冷卻循環槽上，凝膠板與冷卻板之間滴加1%的曲拉通，注意不能有氣泡。然后將電極條分別用0.2m01/L磷酸溶液和0.2mol/L乙醇胺浸濕。正極放置經 0.2mol/L磷酸溶液浸濕的濾紙條，負極放置經0.2mol/L乙醇胺浸濕的濾紙條；③打開冷卻循環泵（LKB MulfiphorⅡ成套電泳系統），4℃循環冷卻，將電極壓在電極條上，接通電源100～450V預電泳30rain；④將加樣條貼在凝膠上，每個加樣條加15/~L待測EDTA抗凝血漿或血清，450V電泳30min，取掉加樣條，450V電泳15～18h；⑤電泳完畢，取出凝膠板放 5X10-5mol/Lh溶液中浸泡10min取出，然后用溶血覆蓋技術進行鑒定，方法同C4溶血覆蓋，不同的是C4溶血覆蓋用的是R4豚鼠血清，C2溶血覆蓋用的是R2人血清。
 
二、平皿法測定補體C2
 
將0.5%EA與缺乏C2的人血清混合，加至加熱溶化后冷至50E的1%瓊脂糖中混合，然后傾注于培養皿中或玻璃板上，制成2mm厚的凝膠。用直徑為2mm的打孔器打孔，然后分別將不同稀釋度的參考血清及待測樣本加入孔內，每孔5ul，放4℃過夜，次日再放37℃溫育1-2h。將參考血清溶血環的直徑（橫坐標）與其含量（縱坐標）繪制標準曲線，根據標準曲線計算待測樣本中C2的濃度。