首先從樣品組織中提取mRNA,在逆轉錄酶的作用下用oligo(dT)作為引物進行RT-PCR合成cDNA,再選擇合適的載體構建cDNA 文庫,對各菌株加以整理,將每一個菌株的插入片段根據載體多克隆位點設計引物進行兩端一次性自動化測序,這就是EST序列的產生過程。