西湖實驗室郭天南團隊利用膨脹水凝膠助力組學分析

　　蛋白質作為疾病生物標志物和藥物靶點在現代生物醫學中具有舉足輕重的作用，蛋白質組學是分析生物體內所有蛋白質的組成與定量的有效手段。傳統的蛋白質組檢測的是整塊組織或分離后的細胞中的蛋白表達水平，失去了空間位置信息。然而，由于組織異質性，組織中不同細胞表達的蛋白種類和數量可能存在顯著性差異，獲得組織空間定位的蛋白表達圖譜有助于解析組織微環境、腫瘤異質性，并在疾病的精細化診斷、藥物選擇及預后評估等方面發揮著重要作用。當前針對蛋白質組開發的空間檢測技術百花齊放，如基于激光捕獲顯微切割（LCM）技術，基質輔助激光解吸電離（MALDI）和液體萃取表面分析（LESA）等。以上技術都在力求使用高精尖的設備實現更高的分辨率下微量樣本的空間蛋白質組學分析。那除此之外，是否還有別的思路呢？

　　西湖實驗室 Kiryl D. Piatkevich 團隊聯合郭天南團隊另辟蹊徑，采取截然不同的方法，首先使用 “吸水后能膨脹到原來的N倍” 的水凝膠放大實際樣品，再結合4D蛋白質組學技術助力微量樣本的蛋白質組學分析，開發了一種簡單、便捷、穩定、可重復的空間蛋白質組學分析方法，并稱之為ProteomEx（該名稱由Proteomics + Expansion合并組成）。這項工作于2022年11月30日發表在Nature Communications，題目為“Spatially resolved proteomics via tissue expansion”。

　　文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34824-2

　　ProteomEx由6個主要步驟組成（圖1），包括組織膨脹、染色、成像、取材、取材組織多肽回收，以及對回收的多肽進行質譜分析。雖然從固定組織到質譜分析的整個過程需要58個小時，而真正需要實驗人員動手操作的時間則不超過5小時，膨脹線性倍數最大可到8倍，相當于體積擴大512倍。且ProteomEx方法無需借助特殊設備，只需通過人工采樣，即可獲取感興趣的單個區域。

　　生物組織的物理放大可以分為四步完成。第一，先用化學錨定分子修飾在樣品的蛋白質上，而錨定分子伸出的手臂可以連接在聚合物網狀結構的分子上。下一步，再用可以形成聚合物的砌塊或者單體擴散到樣品里。接著，通過聚合反應，單體可以在生物分子之間自組裝成長鏈。非常重要的是，在聚合過程中生物分子可以牢固地結合在聚合物的網篩上。而這個結合，可以允許把生物分子拉開。之后，通過使用一種特殊篩選的化合物處理之前形成的聚合物復合物，從而去除生物分子之間的聯系，避免影響后續的膨脹過程。與此同時，當加入水后，聚合物材料可吸水膨脹，聚合物鏈延展開來，如動畫里展示的內容，生物分子也會隨之分開。

　　對于ProteomEx這項全新開發的技術，研究者們首先對它與其他幾種已有的蛋白質組學方法（溶液內酶解方法In-solution、壓力循環技術酶解方法PCT）進行了多個維度的比較。此外，在本研究的進行過程中，Drelich等人發表了一種概念上相似的方法proExM-MS，研究人員也將它納入了比較。結果顯示，與In-solution、PCT、proExM-MS相比，ProteomEx在蛋白質鑒定的定性、定量、翻譯后修飾等方面與其他方法結果相接近，同時可實現更高的多肽提取效率和更低的肽段漏切率，從而穩定獲取空間橫向分辨率~160 μm的微量樣本，相當于0.61 nL的組織體積。

　　與此同時，為了評估ProteomEx對哺乳動物不同組織的適用性。研究人員分別在四種不同的小鼠組織類型上進行了測試，包括腦、肝、乳腺癌和肺（圖3），并計算在長度為1500 μm的組織擴展后特征測量的均方根（RMS）長度測量誤差來評估ProteomEx的各向同性。結果顯示腦、肝、乳腺癌和肺組織樣本的RMS誤差分別為測量距離的~8%、~10%、~8%和~10%，使用DDA采集模式對每一種組織類型的~5 nL體積進行測試，在腦、肝和乳腺癌樣本分別實現了 24,436/3540, 14,298/2606, 9623/2356 個多肽/蛋白質的鑒定量。

　　最后，研究團隊使用ProteomEx技術應用于阿爾茲海默癥模型及其對照小鼠的大腦研究（圖4）。從皮質（V1）、海馬區CA1（CA1）、海馬區CA3（CA3）、齒狀回（DG）和內側膝狀復合體（MGC）共獲取了144個含有具體定位信息的樣本，通過多肽提取及質譜分析，共鑒定到51,203條多肽，對應6233種蛋白。從全局蛋白組表達層面來看，年輕小鼠在疾病組與對照組差異并不顯著。而在老年組的小鼠中，海馬區差異蛋白最多，而相比之下，V1區只有6個差異蛋白，MGC區有1個差異蛋白。在對海馬區的進一步亞區域水平解析上，相比于CA3和DG區域的變化，海馬中的CA1在蛋白質組層面變化最明顯，有198個差異蛋白，后續研究者們根據CA1中變化的蛋白種類與定量，重點探討了其背后的生物學通路和功能變化。這些結果表明ProteomEx可以有效地研究阿爾茲海默癥的病理異質性。

　　綜上，ProteomEx技術為分析亞納升體積的組織的空間蛋白質組學分析提供了一種簡單實用的替代方法。由于ProteomEx類似于蛋白質保留擴展顯微鏡，它在未來可以與細胞結構的超分辨率顯微鏡以及DNA和RNA熒光原位雜交相結合，從而實現空間多組學方法。

　　西湖大學科研助理李璐（現浙江大學博士生，西湖大學訪問學生，郭天南教授團隊），西湖大學科研助理孫翠驥（KirylD.Piatkevich教授團隊），西湖大學博士后孫耀庭（郭天南教授團隊）、西湖大學博士后董振（郭天南教授團隊）為本文共同第一作者，西湖實驗室郭天南博士和Kiryl D. Piatkevich博士為本文共同通訊作者。該研究受到科技部重點研發項目、國家自然科學基金、西湖大學、西湖實驗室的資助和支持。